Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

5. 
   Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
   
   1. 
      Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
      

Dư lượng kháng sinh trong tôm tác động xấu cho người tiêu dùng đã được cảnh báo từ nhiều năm trước nhưng đến nay vẫn còn tồn tại vì thế các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này hiện rất quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện sự bền vững trong nuôi tôm theo định hướng bảo vệ môi trường và sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn.

Vì vậy đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là Metronidazole sulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxazon (SMX) được sử dụng nhiều trong chăn nuôi.

Mục tiêu của đề tài chính là cần tìm ra phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các chất trên trong tôm cho độ nhạy, độ chính xác cao mà đơn giản, phù hợp với trang thiết bị sẵn có. Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là detector UV-Vis.

Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định

đồng thời các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector UV-Vis.

Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:

Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng thời năm chất bằng HPLC:

• 
  Chọn bước sóng của detector
  
• 
  Chọn pha tĩnh
  
• 
  Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…
  
• 
  Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
  
• 
  Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo.
  

• 
  Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi
  

6. 
   Phương pháp nghiên cứu
   

1. 
   Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC [4 ; 8]
   

(t

Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:

• 
  Tương tác hấp phụ
  
• 
  Tương tác trao đổi ion
  
• 
  Tương tác theo cơ chế rây phân tử
  
• 
  Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
  
• 
  Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP - HPLC)
  
• 
  Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)
  
• 
  Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC)
  

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

2. 
   Phân tích định lượng bằng HPLC
   

H = k.C^b

S = k.C^b

Trong đó:

H - chiều cao pic sắc ký của chất

S - diện tích pic sắc ký của chất

k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1

Ở vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:

H = k₁.C = f(C)

S = k₂.C = f(C)

Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn. Dùng phương pháp đường chuẩn thì nhanh, đơn giản. Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn.

Đối với các pic tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn. Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích. Nên trong phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic. Tuy nhiên đối với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc đo diện tích píc lại chính xác hơn.

Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng độ chất theo phương pháp thêm chuẩn.

7. 
   Giới thiệu chung về phương pháp chiết pha rắn [9]
   

Nguyên tắc chung của phương pháp chiết pha rắn.

Chiết pha rắn là quá trình chuyển chất tan (chất phân tích) từ pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích. Quá trình chiết pha rắn được tiến hành qua 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Hoạt hoá chất hấp thu (pha rắn): Người ta cho dung môi chảy qua cột chiết để thấm ướt các hạt pha rắn, hoạt hoá các nhóm chức, đuổi bọt khí, lấp đầy dung môi vào các khoảng trống. Sau khi hoạt hoá, pha rắn cần được ngâm trong dung môi.

Giai đoạn 2: Cho mẫu phân tích chảy qua cột chiết. Các chất phân tích bị hấp thu thành dải ở phần đầu của cột chiết nhờ lực tương tác Van-de-van (Vanderwaals), cũng có thể lực liên kết hidro; lực lưỡng cực - lưỡng cực hoặc theo cơ chế trao đổi ion.

Giai đoạn 3: Giai đoạn làm sạch mẫu phân tích.

Người ta tiến hành rửa cột chiết bằng dung môi để loại bỏ các chất lạ bị hấp thu cùng với chất phân tích.

8. 
   Hoá chất và dụng cụ
   
   1. 
      Hoá chất
      

Dung dịch gốc 1000 g/ml được pha từ lượng cân trong metanol tinh khiết HPLC, dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở 4^oC. Các dung dịch chuẩn được pha từ dung dịch gốc bằng dung môi giống như pha động chạy sắc ký để tránh pic ảo do sai khác dung môi gây ra.

Metanol (MeOH), axetonitril (ACN), axít axetic, muối natri axetat loại tinh khiết HPLC của hãng Meck, Đức.

Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách: chuẩn bị 2 dung dịch:

- Dung dịch CH₃COONa.H₂O có nồng độ 100mM: cân một lượng chính xác chất phân tích loại tinh khiết đã tính trước, hoà tan bằng nước cất hai lần, chuyển vào bình định mức dung tích 250ml, định mức.

- 250ml dung dịch axit acetic nồng độ 100mM: được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ axit acetic đặc của Meck.

- Chỉnh pH của dung dịch bằng cách trộn dung dịch CH₃COONa.H₂O và axit acetic với tỉ lệ xác định, sao cho nồng độ đệm bằng 10mM.

2. 
   Dụng cụ
   

Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer – Đan Mạch với điện cực thuỷ tinh Red – Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động.

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm:

• 
  Bộ loại khí cho dung môi, Degasser – DGU-14AM
  
• 
  Van trộn dung môi FCV-10AL_VP.
  
• 
  Bơm dung môi bốn kênh LC-10AT_VP.
  
• 
  Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-10 AS_VP
  
• 
  Van bơm mẫu 6 chiều VS-7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòng mẫu (sample loop) 20µl.
  
• 
  Detector UV – Vis SPD- 10AV_VP.
  
• 
  Hệ điều khiển SCL-10A_VP
  
• 
  Phầm mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1.
  

Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy, máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác.

Dựa trên cấu trúc của các SAs, MTD trong phân tử đều có chứa vòng liên hợp và chứa các nhóm mang màu và trợ màu làm tăng khả năng hấp thụ trong vùng tử ngoại. Tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng UV trên máy UV-Vis 8453 trong những điều kiện sau:

Kết quả được thể hiện ở hình 3.1:

a/SGU	b/MTD
c/SMP	c/SDO
d/SMX	Chồng các phổ: 1:SGU, 2:SDO, 3:SMP, 4:SMX, 5:MTD
Hình 3.1: Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các SAs

Qua đồ thị chúng tôi thấy: tại bước sóng 270nm các chất SGU,SMP,SDO, SMX đều đạt diện tích pic cực đại, tuy nhiên đối với MTD tại bước sóng 270nm thì diện tích chưa đạt cực đại. Khảo sát thêm khoảng bước sóng 300 – 330nm đối với MTD, chúng tôi thấy MTD đạt diện tích cực đại tại bước sóng 320nm(S_pic = 258931 mAu.s). Kết quả sự phụ thuộc của diện tích pic vào bước sóng phù hợp với việc quét phổ hấp thụ UV- Vis riêng rẽ các chất. Như vậy, để định lượng tốt nhất 5 chất phân tích, chúng tôi đặt detector ở 2 kênh 270nm và 320nm trong quá trình chạy sắc ký.

Thời gian lưu được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Thời gian lưu phụ thuộc vào:

• 
  Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp..)
  
• 
  Pha động chạy sắc ký( loại dung môi, thành phần, tốc độ…)
  
• 
  Bản chất và cấu trúc phân tử của các chất phân tích.
  
• 
  Môi trường pH của pha động.
  

a/SGU	b/MTD
c/SMP	d/SDO
e/SMX	Hình 3.3: Thời gian lưu của các chất phân tích

Dựa vào việc khảo sát thời gian lưu đối với các chất phân tích chúng tôi biết được thời gian lưu cụ thể của từng chất làm cơ sở cho quá trình phát hiện định tính rồi định lượng các sulfamit, metronidazole trong các đối tượng nghiên cứu sau này.

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định tới hiệu quả tách. Bản chất pha tĩnh quyết định cơ chế tách và khả năng lưu giữ của chất tan. Tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà chọn loại pha tĩnh, kích thước hạt nhồi, chiều dài cột cho phù hợp quá trình sắc ký.

Hệ pha ngược được ứng dụng phổ biến do độ ổn định, độ lặp lại và khả năng tách được nhiều loại chất. Ngoài ra dung môi khi sử dụng cho pha ngược có tính kinh tế hơn. Để nghiên cứu tách và xác định các SAs, MTD đa phần là chất phân cực do đó chủ yếu các công trình công bố đều sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo như RP- C₄, RP – C₁₂ ….Cột RP – C₁₈ với kích thước hạt nhồi 5µm của hãng Sulpenco- Australia được chọn để tách các chất trên.

3.3. Tối ưu hoá pha động

3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động

Các giá trị nồng độ dung dịch đệm được lựa chọn khảo sát trong khoảng 2 – 20mM. Điều kiện đo như sau:

(a)	(b)
(c)	(d)
(e)	Hình 3.5: Pic sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác nhau a. 2mM b. 5mM c. 10mM d. 15mM e. 20mM

Dựa vào bảng kết quả và đồ thị nhận thấy: khi thay đổi nồng độ dung dịch đệm thì hệ số dung tích của nó hầu như không thay đổi. Hơn nữa, nhìn trên sắc đồ thì nồng độ đệm không có sự ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng tách và thời gian xuất hiện pic, diện tích pic sắc ký. Tại một nồng độ dung dịch đệm nhất định trong pha động hệ số dung tích của các chất phân tích có sự khác nhau rõ rệt, như vậy đã có sự tách tốt giữa các chất trong quá trình sắc ký .Với khoảng nồng độ đệm tiến hành khảo sát thì pic sắc ký đều rất sắc nét và riêng biệt. Dựa trên những nhận xét đó nồng độ dung dịch đệm thích hợp trong pha động được lựa chọn là 10mM.