MỤc lục danh mục từ viết tắt danh mục bảng biểu danh mục hình vẽ MỞ ĐẦU

MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí, sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng chảy ở khoảng 159^oC – 163^oC. Metronidazol khó tan trong nước, aceton.

• 
  SAs có tính chất lưỡng tính:
  

• 
  Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít. Ví dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl loãng.
  
• 
  Có tính axít do có nguyên tử H ở N-amit linh động, nên dễ tan trong dung dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):
  

• 
  SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag⁺, và tạo phức màu kết tủa với ion Cu²⁺, Co²⁺, …
  
• 
  Ở nhóm amin bậc một của SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện phản ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước sóng hấp thụ cực đại ở 270-273 nm.
  
• 
  Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hoá, rồi ngưng tụ với naphtol cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm.
  

Muối diazoni

Ở đây, Ar – là thành phần -C₆H₅-SO₂NH-R₁ của phân tử SAs.

Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.

3. 
   Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]
   

SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen... Ít hoặc không tác dụng trên một số vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia... Không có tác dụng đối với virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum). Nhưng lại có tác dụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.

Tính hấp thu và đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, các SAs nói chung đều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độ khác nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau.

Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vi khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B. fragilis), Fusobacterium Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm cả C. difficile và C. perfringens), Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu quả đối với B. fragilis phân lập kháng với clindamycin..

Metronidazole cũng có những hoạt động ức chế miễn dịch và kháng viêm, và nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các hoạt động kháng khuẩn của metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật trong đường ruột, giảm ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát.

3. 
   Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3]
   

- Ức chế enzym chuyển hóa acid folic

Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolat synthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic.

- Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn

Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:



Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein

Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trí của A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp axít này. Khi nồng độ đủ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí của A.PAB làm cho việc tổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng ở máu trong suốt thời gian dùng SAs.

SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình dạng, kích thước và nhóm chức hoá học:

Ở ngoài mặt phẳng

A.PAB Sulfamit

Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có sẵn trong môi trường thì không bị SAs tác dụng. Tế bào của người và động vật lấy axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B₉), nên không bị ảnh hưởng bởi SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc trên vi khuẩn.

anion sulfamit	anion PAB

Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori và Gardnerella vaginalis, nhưng cơ chế của hành động này là chưa được hiểu rõ. Tuy nhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy ra thông qua một quy trình bốn bước:

- Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí.

- Làm suy giảm hoạt hóa bởi sự vận chuyển protein trong tế bào: Metronidazole làm giảm bởi pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển các điện tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) trong ty thể của vi khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học của nó.

Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylation oxy hóa của pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro của nó hoạt động như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho các ion hydro trong chu kỳ này. Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc đẩy hình thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào.

- Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND.

- Sự phá vỡ của các sản phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động.

3. 
   Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9]
   

1. 
   Sulfaguanidin (SGU)
   

SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất không thể thiếu cho sự phát triển của vi khuẩn. Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãm quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩn mạnh, được dùng như một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứng phù, tăng huyết áp...

SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ ở ruột nhanh hơn, nhiều hơn và đào thải rất chậm nên đạt được nồng độ cao trong máu, đồng thời duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy dùng liều thấp hơn, ít nguy cơ kết tinh ở đường tiết niệu song cần đề phòng nguy cơ tích luỹ gây ngộ độc vì sự đào thải chậm. SMP dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, sinh mủ, viêm (hoặc giãn) phế quản, viêm đường niệu đạo (bể thận, ruột thận), viêm họng, màng não tuỷ, v.v...

SDO chỉ định các nhiễm khuẩn do tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli, phế cầu. Dung dịch muối natri tiêm tĩnh mạch cho các trường hợp nhiễm khuẩn nặng, trị sốt rét. Muối Ag của SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn mủ xanh, chữa bỏng. SDO cũng có tác dụng kéo dài.

SMX có tính kháng khuẩn mạnh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợp với pyrimethamin, do ức chế men dihydropholat nên ngăn cản sự chuyển hóa axít dihydrofolic. SMX còn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, tai - mũi - họng, đường tiết niệu, thận, máu, bộ phận sinh dục, đường tiêu hoá, v.v...

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi trường... đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.

Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs trong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao...

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải. Ngày nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phát hiện được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) nhất là tách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng detector UV-Vis hay detector huỳnh quang. Dùng detector UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất hơn, nhưng detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu.

Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfa-methazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone sulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng HPLC- detector huỳnh quang. Điều kiện chạy sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm 100-5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H₃PO₄ 0,02M và hỗn hợp metanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H₃PO₄ và đến 45 phút 45 % H₃PO₄, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10l. Bước sóng kích thích 405nm, bước sóng phát xạ 495nm. Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 60-70 %, với giới hạn phát hiện nhỏ hơn 5 g/kg.

Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine (SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX)) trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đảo, detector UV tại bước sóng 266nm. Điều kiện chạy sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh A: amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B: ACN. Sử dụng gariend pha động như sau: ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95% A- 5%B. Tốc độ pha động 1ml/phút. Nồng độ của SAs được phát hiện trong mẫu từ 11 tiểu bang trên bán đảo Malaysia là 0,006-0,062 μg/g trong nhu mô và 0,08-0.193 μg/g trong gan .

Rodrigo H.M.M. Granja, Alfredo M. Montes Niño, Fernanda Rabone and Alessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử dụng phương pháp HPLC –detector UV để xác định sunfamit trong mật ong. Sulfonamid được trích xuất từ ​​mật ong với dichloromethane sau khi giải thể với clorua natri 30%, và làm sạch với chiết pha rắn trên các cột Florisil. Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện tia cực tím. Các giới hạn phát hiện được xác định tại 3 μg/kg, 4 mg/kg và 5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, tương ứng với hiệu suất thu hồi 61,0% cho sulfathiazole; 94,5% cho sulfamethazine và 86,0% cho sulfadimethoxine ở mức 100μg/kg.

Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thường dùng, nhiều công trình nghiên cứu còn sử dụng detector khác như detector diode array (DAD), detector điện hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.

Tác giả Ivan Pecorelli và các đồng sự [18], sử dụng phương pháp HPLC - DAD để phân tích đồng thời dư lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfa-chlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện chạy sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5m). Pha động là axetonitril (A) và dung dịch đệm axetat pH = 4,5(B), chạy gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41% B, tốc độ pha động 0,4 ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị mẫu: Cân 10g mẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào đó 10g Na₂SO₄ khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml. Quá trình chiết như vậy được lặp lại lần hai. Kết hợp hai phần chiết lại đem cô cạn bằng hút chân không. Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: Cột Speedisk được hoạt hoá bằng 2×3ml n-hexan và 2×4ml etyl axetat. Sau khi bơm mẫu vào cột được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa giải bằng 20ml hỗn hợp metanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích). Dung dịch thu được làm khô trong điều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 4,5 với 0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2l trước khi bơm vào máy HPLC. Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới hạn phát hiện 0,05 g/kg.

W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xác định đồng thời mười hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorpyrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận của lợn, gà... Điều kiện chạy sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C₈ (250 × 2mm, kích thước hạt nhồi 5m). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và axetonitril (B), chạy gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động 0,35 ml/phút. Detetor DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối với chất nội chuẩn). Phương pháp này có giới hạn phát hiện các SAs là 1ppb.

Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác định

PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư lượng sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine, , sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC với dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột. Chất dẫn xuất hóa được sử dụng ở đây là OPA (o-phthldialdehyde) kết hợp với β-mercaptoethanol (ME). Phát hiện huỳnh quang: E_ex =302nm; E_em = 412nm. Xây dựng đường chuẩn: Pha động ban đầu: acetonitrile-nước (3:97) trong 5 phút sau đó gradient tuyến tính từ(3:97) đến (40:60) trong 15 phút. Cuối cùng, lặp lại điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút, tốc độ 0,5ml/phút. Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trong ethanol 2% 0,7M H₃PO₄) được thêm bởi bơm nhu động tại tốc độ 0,25ml/phút. Chúng được trộn lẫn và phản ứng trong cuộn PTFE (2,5 0,8 I.D) ở 40^oC. Đường chuẩn của sulphamethoxazole từ 0,01 -2 µg/ml, các sulfamit còn lại 0,02 -2 µg/ml.

Craig D.C. Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương pháp HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit (sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline, sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mô lợn, gan bò, cừu ,ngựa , thịt gà, gan cá, thức ăn chăn nuôi. Mẫu trích được bảo quản trong đệm pH 3,0-ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine. Các chất dẫn xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động: acid phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (E_ex = 405 nm; E_em = 495nm). Giới hạn phát hiện (LOD) cho tất cả các sulfamit được 0,01 μg/g, ngoại lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μg/g.

Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, Jie Han[23] cũng xác định dư lượng đồng thời là 12 sulfamit (sulphadiazine, sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine, sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonomethoxine, và sulphachloropyridazine) trong các mô động vật (gan lợn, thịt gà, bắp thịt bò) bởi HPLC với detecto UV. Chất dẫn xuất hóa trước cột của các hợp chất sulfamit với 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) đã được đề xuất và các điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa. Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất sulfamit đã được cải thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá. Dư lượng sulfamit trong mô động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn với C18. Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung bình trên 70%. Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đạt 3-5 μg/kg.

HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole trong những năm gần đây.

Năm 2007 Naser Tavakoli[20]và cộng sự cũng đã sử dụng HPLC để xác định đồng thời metronidazole và amoxicillin. Điều kiện sắc ký: cột C18, pha động pH =4, phát hiện bởi detector UV tại bước sóng 254nm. Khoảng tuyến tính của amoxicillin 0,15- 600(mg/ml); metronidazole 0,13 -300mg/ml. Giới hạn phát hiện của amoxicillin (LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 0,1mg/ml, LOQ:0,13mg/ml).

Cũng vào năm đó Han-Wen Sun[17] đã xác định đồng thời dư lượng 7 nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole, secnidazole và các chất chuyển hóa chung của ronidazole và hydroxydimetridazole trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha động H₂O- ACN, detector UV phát hiện tại bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi cho các mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5%. Khoảng tuyến tính từ 0,7 -60mg/kg. Độ lệch chuẩn tương đối của 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn và thịt xông khói tăng, ở nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%.

Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng thời metronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện sắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa giải gradient 0,05M đệm phosphate (pH =2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút. Khoảng tuyến tính của metronidazole: 0,005-1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g. Khoảng tuyến tính của piamycin: 0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g.

1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau

Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam (penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước thải bệnh viện. Phương pháp phân tích là HPLC – MS. Các chất phân tích có nồng độ thay đổi theo thời gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h. Nồng độ chất phân tích thay đổi trong phạm vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole 0,1-90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l); trimethoprim 0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l).

Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng thời 7 sulfamit (sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonomethoxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm bằng sắc ký HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6 mm, 5µm). Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút. Phát hiện bởi detector PDA tại 268 nm. Giới hạn định lượng 3 - 80 mg/g. Khoảng tuyến tính của các sulfamit 20-200 mg/ml. Khoảng tuyến tính của metronidazol, chloramphenicol 40-400 mg / ml. Hiệu suất thu hồi trung bình là 83,8% - 105,3% . Độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5%. Phương pháp này thường được sử dụng cho việc xác định bảy sulfamit và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩm.