LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng
Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph
tải về 4.32 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid
3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmidĐể thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp, vector pCAMBIA1300 được sử dụng làm vector nhận và đoạn chèn được thu nhận lại từ vector trung gian có kí hiệu pKS_xylB_hph cùng được cắt bằng enzyme Kpn I. Kpn I có vị trí cắt ở hai đầu của hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph nằm trên vector trung gian, do đó khi xử lý vector trung gian bằng Kpn I, chúng tôi sẽ thu được đoạn gen mong muốn để nối ghép với vector pCB1300, tạo thành vector biểu hiện. Vector này có cấu trúc bao gồm: (đoạn khởi đầu GpdA + xylB + đoạn kết thúc TrypC) và (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC). Đoạn DNA chèn và vector nhận sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn Kpn I và thu lại nhờ tinh chế sản phẩm trên gel agarose sẽ được nối ghép với nhau bằng phản ứng lai dưới sự hỗ trợ của enzyme T4 DNA ligase. Ti plasmid tái tổ hợp tạo thành mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B, có kích thước phân tử khoảng 15,4 kb. Kích thước này lớn hơn so với kích thước của vector pCB1300 do vậy, dưới điện trường, DNA plasmid của Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph sẽ di chuyển chậm hơn so với DNA plasmid của vector pCB1300. Một số khuẩn lạc được nhặt nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/ml) ở 37°C qua đêm, sau đó kiểm tra DNA plasmid để lựa chọn các dòng cao hơn trên hình ảnh điện ảnh di để tiến hành kiểm tra sự có mặt của xylB trong Ti plasmid tái tổ hợp. 3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmidDòng khuẩn lạc có kí hiệu pCB_xylB_hph lần lượt được cắt kiểm tra bằng một enzyme là Kpn I, Bgl II và kết hợp hai enzyme Bgl II và Nco I. Enzyme giới hạn Kpn I để dùng để cắt vector trung gian pKS_xylB_hph với mục đích tinh chế đọan gen cần nối ghép với vector pCB1300 và vector nhận pCB1300 cũng được cắt mở vòng bằng Kpn I nên điểm cắt của Kpn I không bị mất. Vì vậy, khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph bằng enzyme giới hạn Kpn I, kết quả thu được là hai đoạn gen có kích thước là 9 kb và 6,4 kb tương ứng với kích thước của pCB1300 và đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Trên hình ảnh điện di (Hình 3. 14), sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme Kpn I gồm hai băng với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Vector pCB1300 được dùng để làm đối chứng chỉ có một băng duy nhất với kích thước khoảng 9 kb. Như vậy, chúng tôi khẳng định đã chuyển được toàn bộ kết cấu gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào Ti plasmid.
~10,7
~ 9 ~ 6,4
~ 4,7 1 2 3 4 5 6 M 7 8 kb 
Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 -> 4150 123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18 123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV 123456789 -> Acknowledgements 123456789 -> Danh mục chữ viết tắT 123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung 123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo) 4150 -> LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng tải về 4.32 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|