Hình 3. 5: Điện di đồ kiểm tra chiều gắn của xylB trong vector tái tổ hợp pAN_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi Seq – F và XylB – R
M: Marker 1 kb
1 – 5: Sản phẩm PCR của các dòng pAN_xylB (6 – 10)
Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp ở giếng số 1 và giếng số 3 (Hình 3. 5) tương ứng với dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1 và pAN_xylB3 xuất hiện băng đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb. Kích thước này đúng bằng kích thước lý thuyết. Như vậy, chúng tôi đã chọn được dòng plasmid tái tổ hợp mang xylB lắp đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pAN7.1 – GluA. Dòng plasmid pAN_xylB6 và pAN_xylB8 được nuôi lượng lớn và giữ chủng nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sau.
3.1.1.2. Lắp ghép xylB trong vector pAN_xylB vào vào vector trung gian
Sản phẩm để nối ghép vào vector trung gian pKS– là cấu trúc gồm: đoạn khởi đầu + xylB + đoạn kết thúc (GpdA + xylB + TrypC) hay còn gọi là cấu trúc biểu hiện xylB, cấu trúc này có kích thước khoảng 4,2 kb. Enzyme Eco RI và Sma I được dùng để cắt hoàn toàn cấu trúc (GpdA + xylB + TrypC) trên vector tái tổ hợp pAN_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm cắt enzyme thu được 4 băng, trong đó có hai băng có kích thước tương đương nhau, khoảng 4, 2 kb nên rất khó phân tách. Đó là hai đoạn tương ứng với đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và một đoạn khác cũng cắt từ vector pAN_xylB. Vì vậy, plasmid tái tổ hợp cần tiếp tục được kiểm tra lại bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme giới hạn.
Sau khi lựa chọn một số dòng cao hơn đối chứng âm (vector pAN7.1 – GluA). DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc này được tinh sạch và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trong vector tái tổ hợp pKS_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi SeqXylB – F và XylB – R.
Kb M 1 2 3 4
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |
