Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen

– Tinh chế đoạn gen và vector: Để nối ghép gen vào một vector, trước hết chúng phải được với cùng một enzyme cắt giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng cho phản ứng nối ghép gen. Ngoài ra, để phản ứng đạt hiệu suất cao cần tinh chế đoạn gen hoặc vector trước khi tiến hành lai. Phản ứng cắt lượng lớn để thôi gel và tinh sạch đoạn gen và vector quan tâm như sau:

Thành phần phản ứng cắt:

H₂O: 48 µl

Buffer: 10 µl

Vector/plasmid: 40 µl

Enzyme cắt giới hạn: 2 µl

Tổng thể tích: 100 µl

Ủ 37° – 2 giờ

– Khử phosphate đối với vector

DNA plasmid sau khi cắt bằng enzyme hạn chế được loại nhóm phosphat ở đầu 5' nhờ enzyme phosphatase kiềm được tách từ ruột bê (CIP = Calf Intestinal Alkaline Phosphatase). Mục đích nhằm tránh hiện tượng đóng vòng trở lại của vector.

• 
  DNA plasmid (10 – 20 g) được ủ với enzyme giới hạn trong 1 giờ. Lấy khoảng 0,3 g điện di trên gel agarose 0,8% cùng với chỉ thị phân tử là DNA plasmid chưa xử lý bằng enzyme. Nếu như quá trình cắt chưa hoàn toàn, bổ sung thêm enzyme giới hạn và ủ tiếp.
  
• 
  Khi DNA đã được cắt hoàn toàn, chiết mẫu với phenol : chloroform và tủa DNA bằng hai thể tích ethanol trong 15 phút ở 0°C. Ly tâm thu DNA ở 4°C, 12000 vòng/phút (v/p) trong 10 phút. Hoà cặn trong 90 l 10 mM Tris.Cl (pH 8,3). Lấy khoảng 200 ng DNA điện di kiểm tra. Mẫu còn lại được giữ ở – 20°C.
  
• 
  Thêm 10 l dung dịch đệm dùng cho CIP và một lượng enzyme thích hợp, ủ ở điều kiện tương ứng.
  

	Lượng enzyme	Điều kiện ủ
Đầu dính 5'	1 unit / 100 pmoles*	ở 37°C trong 30 phút
Đầu bằng	1 unit / 2 pmoles	ở 37°C trong 15 phút. Sau đó thêm một lượng enzyme và tiếp tục ủ ở 55°C trong 45 phút.

• 
  Sau khi ủ, thêm vào mẫu SDS và EDTA (pH 8,0) đến nồng độ cuối cùng tương ứng là 0,5 % và 5 mM. Trộn đều và thêm proteinase K 100 g/ml. Ủ 30 phút ở 56°C. Proteinase K dùng để hoà tan CIP nhằm loại bỏ chúng hoàn toàn giúp cho quá trình gắn gen vào vector có hiệu quả. CIP cũng có thể bị làm bất hoạt bằng cách ủ 1 giờ ở 65°C hoặc 75°C trong 10 phút cùng với 5 mM EDTA (pH 8,0).
  
• 
  Sau đó làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng. Chiết DNA một lần bằng phenol, một lần bằng phenol : chloroform. Bổ sung Na – acetate 3M, pH 7,0 (nếu pH = 5,2 như thông thường thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ > 5 – 10 mM) theo tỷ lệ thể tích 1: 10. Trộn đều và thêm 2 lần thể tích ethanol 100%. Đảo đầu ống Eppendorf vài lần. Giữ ở 0°C trong 15 phút.
  
• 
  Ly tâm 12000 v/p, 10 phút, 4°C để thu DNA. Rửa cặn bằng ethanol 70%, ở 4°C. Làm khô DNA và hoà trong TE (pH 7,6) và bảo quản ở – 20°C.
  

H₂O: 29 µl

Buffer CIAP: 5 µl

CIAP: 1 µl

Vector: 15 µl

Tổng thể tích: 50 µl

Ủ 37° – 1giờ và dừng phản ứng ở 65° – 15 phút

* Tinh chế các đoạn DNA và vector tách dòng trên gel agarose

Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài các vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-), trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard^®SV. Quy trình tinh sạch DNA gồm các bước sau:

• 
  Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng gel và chuyển vào ống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được.
  
• 
  Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ 10 µl dung dịch/10 mg gel.
  
• 
  Vortex và ủ ở 50 - 65˚C cho đến khi gel tan hoàn toàn.
  

• 
  Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch).
  
• 
  Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
  
• 
  Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection.
  

• 
  Bổ sung 700 µl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại bỏ phần dịch phía ở ống phía dưới cột Collection.
  
• 
  Rửa lại 1 lần bằng cách bổ sung tiếp 500 µl dung dịch rửa, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch ở ống phía dưới cột Collection.
  
• 
  Ly tâm tiếp cột 12000 v/p trong 1 phút, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để bay hơi hết lượng cồn còn lại.
  

• 
  Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml sạch.
  
• 
  Bổ sung 50 µl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút.
  
• 
  Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4˚C hoặc -20˚C.
  
• 
  Kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel 0,8 % agarose.
  

Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo Kit tách dòng CloneJET^TM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme Taq DNA polymerase hoặc đã được cắt bằng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt tương ứng.

Vetor và đoạn DNA ngoại lai sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn, tinh chế và được tiến hành nối ghép theo phản ứng như sau:

H₂O: 5µl

T4 ligase buffer : 2µl

Vector: 2µl

T4 DNA ligase: 2µl

Sản phẩm cắt enzyme: 9µl

Tổng thể tích: 20µl

Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 0° – 18°C trong 16 giờ.

- Phương pháp ghép nối các đoạn DNA vào vector: các đoạn gen và vector sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn phù hợp sẽ được ghép nối với nhau nhờ enzyme T4 ligase, phản ứng thực hiện ở 14˚C trong 12 giờ. Đặc biệt trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tính chất đặc biệt của 2 loại enzym giới hạn Bam HI (GGATCC) và Bgl II (AGATCT) có 4 điểm nhận biết ở giữa giống nhau, tạo ra đầu dính giống nhau là GATC. Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tiến hành ghép nối đoạn DNA được cắt bằng Bam HI với đoạn DNA được cắt bằng Bgl II, khi đó trong phân tử DNA lai điểm cắt của hai enzyme này bị thay đổi.

2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens

Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất hoặc điện trường sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc.

• 
  Nhặt một khuẩn lạc cấy ria lên đĩa LB đặc, ủ ở 37°C qua đêm.
  
• 
  Nhặt 1 khuẩn lạc trên đĩa ủ qua đêm và nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C qua đêm.
  
• 
  Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy sang 30 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 3 giờ.
  
• 
  Chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã được làm lạnh trên đá, ly tâm 5000 v/p, 4°C trong 10 phút để thu cặn.
  
• 
  Hòa tan cặn nhẹ nhàng (có thể dùng đầu côn để làm tan tế bào) trong 0.7 đến 1.5 ml dung dịch CaCl₂ (tùy theo lượng tế bào nhiều hay ít), ly tâm 5.000 v/p, 4°C, 10 phút để thu cặn.
  
• 
  Tiếp tục lặp lại bước trên 1–2 lần.
  
• 
  Bổ sung glycerol 60% theo tỷ lệ 1 : 2 so với lượng CaCl₂ dùng để rửa, dùng pipet trộn đều nhẹ nhàng.
  
• 
  Hút 80 µl – 100 µl vào ống Eppendorf 1.5 ml đã được giữ lạnh trên đá và cất ngay trên đá hoặc bảo quản ở tủ –80°C.
  
• 
  Tế bào khả biến có thể dùng ngay hoặc để trên bình đá hay cất vào tủ lạnh dùng trong 3 ngày hoặc làm lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở –80°.
  

• 
  Đặt tế bào khả biến E. coli DH10b hoặc E.coli DH5α vào đá khoảng 30 phút nếu tế bào khả biến cất giữ ở – 80°C.
  
• 
  Bổ sung 5l sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli DH10b hoặc E. coli DH5α, đảo nhẹ và ủ trong đá 15 phút.
  
• 
  Sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây, đặt ngay vào đá 5 phút.
  
• 
  Bổ sung 300 l môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 1 giờ.
  
• 
  Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin hoặc kanamycin (50mg/ml).
  
• 
  Nuôi ở 37°C qua đêm, chọn các khuẩn lạc.
  

• 
  Làm mới giống trên môi trường thạch YEB có bổ sung kháng sinh thích hợp.
  
• 
  Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 28°C, 6 – 8 giờ.
  
• 
  Lấy 1 ml dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 100 ml môi trường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD_660nm đạt 1– 1,5.
  
• 
  Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào Rửa cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N’–2–ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol.
  
• 
  Cặn hòa lại trong 500 – 700 l 10% glycerol.
  
• 
  Chia 100 l dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C.
  

• 
  Vector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch là 40 – 50 ng/µl.
  
• 
  Làm tan tế bào khả biến (TBKB) trên đá 30 phút.
  
• 
  Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai.
  
• 
  Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet.
  
• 
  Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.
  
• 
  Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ.
  
• 
  Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày.
  
• 
  Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích hợp.
  

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc:

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương.

Quy trình:

• 
  Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.
  
• 
  Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.
  
• 
  Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút).
  
• 
  Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (nồng độ 10 g/ml) trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất.
  
• 
  Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio – Rad với tia UV có bước sóng 320 nm.
  

2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu.

Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]:

• 
  Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn.
  
• 
  Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.
  
• 
  Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C.
  

Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi.

PCR bao gồm các thành phần sau đây:

• 
  Một đoạn DNA khuôn.
  
• 
  Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide.
  
• 
  Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
  
• 
  Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt.
  

Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%.

Thành phần phản ứng chạy PCR:

dNTPs (10 mM) : 1l

Buffer (10 X) : 2.5l

Primer F (10 µM): 1l

Primer R (10 µM): 1l

Taq (5 U/ul): 0.2l

H₂O: 18.3l

DNA plasmid: 2l

Tổng thể tích: 25 l

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph:

94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C

5 phút 43 giây 1 phút 1 phút _{25chu kỳ} 10 phút

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ

Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 v/p.

* Quy trình tách DNA plasmid từ E. coli

• 
  Cấy một khuẩn lạc vào ống penicillin đã bổ sung 2 ml môi trường LB lỏng chứa kháng sinh thích hợp. Nuôi qua đêm ở 37°C trong điều kiện lắc 200 v/p.
  

Lưu ý:

• 
  Thể tích ống penicillin phải lớn gấp 4 lần thể tích nuôi cấy.
  
• 
  Các ống phải đậy nắp không chặt quá.
  
• 
  Dịch nuôi phải được nuôi cấy trong điều kiện lắc nhẹ.
  

• 
  Chuyển 1,5 ml dịch nuôi sang ống Eppendorf. Ly tâm ở 11000 v/p ở 4°C trong 30 giây. Loại bỏ dịch môi trường để thu cặn tế bào. Lưu giữ những dịch nuôi cấy chưa sử dụng hết ở 4°C.
  
• 
  Làm tan cặn tế bào trong 100 l dung dịch Sol I (giữ trong đá) bằng máy vortex.
  
• 
  Bổ sung 200 l dung dịch Sol II (mới pha) vào mỗi Eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút. Không được vortex.
  
• 
  Bổ sung 150 l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ ở 0°C trong 3 – 5 phút.
  
• 
  Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 4°C và hút chuyển dịch sang ống mới.
  
• 
  Bổ sung một thể tích tương đương phenol : chloroform. Đảo lẫn hai pha bằng cách vortex và ly tâm ở 12000 v/p trong 2 phút ở 4°C. Hút chuyển pha trên sang ống mới.
  
• 
  Tủa nucleic acid bằng cách bổ sung 2 lần thể tích ethanol 98%. Trộn đều bằng vortex và giữ ở – 20°C trong 3 giờ.
  
• 
  Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 20 phút ở 4°C.
  
• 
  Loại sạch ethanol và bổ sung 1 ml ethanol 70%. Ly tâm thu tủa 12000 v/p trong 8 phút ở 4°C.
  
• 
  Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
  
• 
  Hoà tan DNA trong 50 l H₂O khử in vô trùng (hoặc 50 l TE pH 8) chứa 20 g/ml RNase.
  
• 
  Kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8 % và giữ mẫu ở – 20°C.
  

* Quy trình tách DNA plasmid từ Agrobacterium

• 
  Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu tủa tế bào.
  
• 
  Bổ sung 10% lyzozyme vào dịch Sol I, bổ sung 150 µl Sol I vào 1 ống ppendorf, đánh tan.
  
• 
  Bổ sung 150 µl Sol I, lắc đều + 150 µl Sol III, đảo đều, bổ sung 1 µl RNAse 1 mM/µl, ủ 37^oC trong 1h, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu dịch.
  
• 
  Bổ sung 1ml EtOH 100%, ủ 3h, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu tủa, bổ sung 30 µl H₂O.
  
• 
  Điện di 8 µl để kiểm tra DNA plasmid bằng agarose 0.8%
  

2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn, DNA plasmid mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra. Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA. Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại.

Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, DNA plasmid thu được từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra bao gồm: Eco RI và Kpn I, Sma I, Hind III, Bgl II, Nco I, Not I. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau:

Eco RI	Dung dịch đệm Eco RI
Sma I	Dung dịch đệm Tango
Hind III	Dung dịch đệm R
Kpn I	Dung dịch đệm Kpn I
Bgl II	Dung dịch đệm Tango
Nco I	Dung dịch đệm Tango
Not I	Dung dịch đệm Tango

Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần:

H₂O: 5.8 µl

Buffer: 1.0 µl

DNA plasmid: 3.0 µl

Enzyme cắt: 0.2 µl

Tổng thể tích: 10 µl

Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 1, 5 giờ và kiểm tra kết quả bằng điện di agarose 0,8%.

2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng

* Nguyên tắc chung

Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase …Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 µl.

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp^® PCR System 9700 như sau: 96˚C - 1 phút; (96˚C - 10 giây; 50˚C - 5 giây; 60˚C - 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩn được giữ ở 4˚C.

* Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA

• 
  Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 µl EDTA 125 mM, 60 µl EtOH 100% và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó ly tâm 12000 v/p, 15 phút để tủa DNA có trong đó.
  
• 
  Bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 µl EtOH 70%. Ly tâm 10000 v/p trong 10 phút.
  
• 
  Làm khô tủa và bổ sung 10 µl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95˚C trong 5 phút.
  
• 
  Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer.
  
• 
  Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µl.
  
• 
  Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2.
  

* Phân tích trình tự gen

Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Bioedit; Seqscape 2.5 và so sánh với trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.

2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger

* Chuẩn bị nấm sợi A. niger để thu bào tử

• 
  Cấy ria từ ống giữ chủng A. niger trong glycerol ở – 80°C lên đĩa nuôi cấy có chứa môi trường PDA. Dịch còn lại giữ ở – 20°C.
  
• 
  Ủ đĩa nuôi cấy ở 30°C trong 3 ngày, trong tối.
  
• 
  Thu hoạch bào tử nấm: bổ sung 5 ml nước muối sinh lý vô trùng và dùng que trải gạt nhẹ nhàng lên bề mặt thạch để thu bào tử.
  
• 
  Chuyển bào tử qua màng lọc vào ống falcon 15 ml và tiếp tục bổ sung thêm 5ml nước muối sinh lý.
  
• 
  Ly tâm 10 phút, 8000 v/p, ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và hòa tan cặn trong 1ml nước muối sinh lý.
  
• 
  Xác định nồng độ bào tử và pha loãng đến nồng độ cuối cùng là 10⁷ bào tử/ml bằng môi trường IM.
  

* Chuẩn bị chủng A. tumefaciens

• 
  A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ hợp được cấy ria lên môi trường LC có bổ sung kháng sinh rifampicin 50 mg/ml để ngăn ngừa sự lây nhiễm các vi khuẩn khác và bổ sung đồng thời cả kanamycin 50 mg/ml để chọn lọc A. tumefaciens có mang Ti plasmid tái tổ hợp. Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày
  
• 
  Nhặt 2 khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy cho vào 20 ml môi trường LC đã bổ sung 50 mg/ml rifampicin và 50 mg/ml kanamycin, nuôi lắc ở 28°C, 250 v/p trong 24 giờ.
  
• 
  Ly tâm dich nuôi cấy trong Eppendorf 1.5 ml trong 10 phút, 6000 v/p ở nhiệt độ phòng. Bỏ dịch nổi, thu cặn và tiếp tục rửa cặn bằng cách hòa tan cặn trong 250 µl dung dịch IM. Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi.
  
• 
  Hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch IM có chứa 5µl AS nồng độ 0.2M
  
• 
  Ủ dịch nuôi cấy ở 28°C từ 4 giờ – 5 giờ, lắc 100 v/p.
  
• 
  Đo OD_600nm và pha loãng ra nồng độ cuối cùng là 0.8 (4.10⁸ – 5.10⁸ vi khuẩn/ml).
  

* Nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger:

• 
  Trộn 100 µl tế bào A. tumefaciens (OD_600nm = 0.8) và 100 µl bào tử nấm (nồng độ = 10⁷ bào tử/ml).
  
• 
  Sử dụng kẹp vô trùng đặt màng lọc lên đĩa petri có chứa môi trường thạch IM đã bổ sung AS 0.2M.
  
• 
  Dùng pipet hút 200 µl hỗn hợp bào tử nấm và vi khuẩn lên trên màng lọc và trải đều bằng que trải.
  
• 
  Ủ đĩa ở 24°C trong 3 ngày.
  

* Chọn lọc nấm chuyển gen:

• 
  Dùng kẹp vô trùng chuyển màng lọc có hỗn hợp dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường PDA đã bổ sung cefotaxim (50 mg/ml) và hygromycin (50 mg/ml)
  
• 
  Ủ đĩa ở 30°C trong 3 ngày, trong tối cho đến khi xuất hiện bào tử.
  
• 
  Nhặt khuẩn lạc sang môi trường chọn lọc để làm sạch và phân lập riêng rẽ từng bào tử.
  
• 
  Giữ chủng và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra cần thiết
  

Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 -> 4150
123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18
123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV
123456789 -> Acknowledgements
123456789 -> Danh mục chữ viết tắT
123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung
123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo)
4150 -> LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng

tải về 4.32 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: