LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng

1.2.2.2. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens.

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1].

* Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA

Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [1, 19].

Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1].

Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11].

1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens

1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger

Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển gen kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15]. Agrobacterium cũng được sử dụng để chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài Aspergillus, bao gồm: A. awamori, A. nidulans, A. niger [22].

Ngành Phân ngành Lớp Bộ Họ Loài

Myxomycota

Eumycota Mastigomycoina

Zygomycotina

Ascomycotina Ascomycetes Eurotiales Eurotiaceae Aspergillus nidulans

Sphaeriales Sordariaceae Neurospora crassa

Basidiomycotina Homobasidiomycetes Agaricales Agaricaceae Agaricus bisporus

Tricholomataceae Pleurotus ostreatus

Deuteromycotiana Deuteromycetes Hyphomycetes Aspergillus niger

Aspergillus awamori

Fusarium solani

Fusarium graminearum

Trichoderma reesei

Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides

Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A. tumefaciens gồm một số bước sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng của A. tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và biên trái của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này; iii) vector tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens có mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn lọc và phân biệt với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA được chuyển vào nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển. Nấm chuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22].

Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. Đó là chúng đều cần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá trình chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi chung (nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc chuyển màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9].

1.2.3.2. Thuận lợi và khó khăn

Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG, bởi các lý do sau:

• 
  Nguyên liệu từ nấm để nuôi nhiễm cùng với A. tumefaciens vô cùng đa dạng. Chúng có thể là bào tử, là thể nguyên sinh, hạt cầu, thể sợi nấm hay bào tử nảy mầm và thậm chí cả cặn tế bào [9, 11, 16]. Nhờ ưu điểm này đã loại bỏ được những trở ngại khi tái sinh thể nguyên sinh khi sử dụng kỹ thuật PEG. Phương pháp chuyển gen truyền thống vào Mucor dựa trên phương pháp PEG đòi hỏi phải có thể nguyên sinh hình thành từ khuẩn ty. Mặc dù hiệu suất chuyển gen cao, nhưng trên thực tế, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để chuẩn bị thể nguyên sinh [18]. Hơn nữa, hiệu suất tái sinh thể nguyên sinh thường gặp nhiều khó khăn và ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chẳng hạn như điều kiện sinh trưởng của bào tử nảy mầm (thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy). Ngoài ra, phương pháp chuyển gen nhờ thể nguyên sinh phải không những đòi hỏi phải tối ứu đối với các enzyme dùng để chuẩn bị thể nguyên sinh [11] mà còn tốn thời gian và tiền của [17].
  
• 
  Tần suất chuyển gen cao: Hầu hết chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium có tần suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống [9, 11, 16]. Chuyển gen vào A. awamori thông qua Agrobacterium có hiệu suất cao gấp 400 lần so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG [9]; Với vật chủ là Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5 – 10 so với chuyển gen nhờ tế bào trần; Với một số vật chủ khác, chẳng hạn như Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [9]. Tương tự, chuyển gen vào A. fumigatus thông qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu suất chuyển gen cao gấp 2 lần so với chuyển gen nhờ các hạt cầu [16].
  
• 
  Chuyển được những đoạn DNA có kích thước lớn. So với các phương pháp cũ chuyển gen vào tế bào trần chỉ có thể chuyển được những đoạn DNA có kích thước khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai nhỏ nhất có thể chuyển vào tế bào thực vật nhờ A. tumefaciens có thể lên đến 150 kb [9].
  
• 
  Các thể chuyển gen nhờ Agrobacterium thu được đều có copy duy nhất, và gen được chuyển hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào genome của tế bào chủ [11, 16].
  
• 
  Phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông Agrobacterium là phương pháp nền tảng trong sản xuất thực phẩm bởi các chủng nấm mốc không chứa các yếu tố kháng kháng sinh vi khuẩn [9].
  

* Khó khăn

Bên cạnh những thuận lợi trên, chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens cũng có bất lợi đó là không thích hợp để tạo ra chủng vi sinh vật nhằm thu lượng lớn sản phẩm protien do chỉ hòa nhập một sao duy nhất T – DNA trong khi cần nhiều bản sao để biểu hiện ra sản phẩm của gen. Tuy nhiên, nhược điểm này có thể khắc phục dễ dàng nhờ chuyển lượng lớn phân tử T – DNA có mang gen mong muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc [11]. Như vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm mốc [9, 11, 12, 16].

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium

• 
  Nguyên liệu nấm
  

Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian bảo quản bào tử nấm. Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệu quả chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử so với nguyên liệu mới [12].

• 
  Agrobacterium và tế bào chủ
  

• 
  Nồng độ chất cảm ứng
  

• 
  Tỷ lệ nuôi nhiễm
  

• 
  Điều kiện cùng nuôi nhiễm
  

Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do Quy trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. Do vậy, để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12].