Hình 3. 14: Điện di đồ sản phẩm cắt enzyme của Ti plasmid tái tổ hợp mang hai cấu trúc biểu hiện gen

1: Vector pCB1300 đối chứng

2: Ti plasmid pCB_xylB_hph đối chứng

3: pCB1300 cắt bằng Kpn I

4: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Kpn I

5: pCB1300 cắt bằng Bgl II

6: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II

M: Marker 1 kb

7: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II và Nco I

8: pCB1300 cắt bằng Bgl II và Nco I

Tiến hành khảo sát thêm một số điểm cắt của enzyme giới hạn trên vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph, enzyme Bgl II và Nco I được dùng để cắt điểm cắt nội trên đoạn gen mang hai cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene +trypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). Vì Bgl II có vị trí nhận biết trên gen mã hóa xylB, nên Bgl II sẽ cắt mở vòng vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph. Vector pCB1300 không có vị trí cắt của Bgl II do đó, DNA plasmid của pCB1300 sẽ không bị cắt, trên điện di đồ vẫn là sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp. Tương tự, Nco I có vị trí nhận biết trên gen mã hóa hph nên khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp bằng Bgl II và Nco I, kết quả sẽ gồm hai băng có kích thước khoảng 10,6 kb và 4,7 kb. Đồng thời, vector pCB1300 được cắt cùng với Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph để làm đối chứng. Với cả hai phương án xứ lý bằng enzyme giới trên đều không có điểm cắt trên vector pCB1300 do đó dễ dàng nhận thấy sự khác biệt giữa sản phẩm cắt của vector pCB1300 và vector lasmid tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph trên điện di đồ. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định đã chuyển được đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph vào vector pCB1300. DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết lượng lớn và tinh sạch cho phản ứng xác định trình tự.

Đoạn gen quan tâm được xác định trình tự theo phương pháp Sanger trên máy xác định trình tự tự động ABI Avant 3100. Trình tự nucleotide của mỗi mẫu được xác định cả hai chiều xuôi và chiều ngược. Trình tự được xử lý bằng các phần mềm ABI PRIMS 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis v5. 2. Trình tự gen thu được tiếp tục được so sánh với các trình tự chuẩn trong ngân hàng gen Quốc tế EMBL/ Genbank/ DDBJ hoặc các trình tự ban đầu của gen nhờ các phần mềm Seqscrape v2. 6 và Bioedit v7. 0. 9 để kiểm tra độ chính xác của trình tự gen.

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

M L T K N L L L C F A A A K A A L A V P

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

H D S V A Q R S D A L H M L S E R S T P

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

S S T G E N N G F Y Y S F W T D G G G D

190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

XylB GTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGTTGAGTGGCCCAACGTGGGCAAC

V T Y T N G D A G A Y T V E W P N V G N

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

F V G G K G W N P G S A Q D I T Y S G T

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

F T P S G N G Y L S V Y G W T T D P L I

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

E Y Y I V E S Y G D Y N P G S G G T Y K

430 440 450 460 470 480

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

G T V T S D G S V Y D I Y T A T R T N A

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

A S I Q G T A T F T Q Y W S V R Q N K R

550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

V G G T V T T S N H F N A W A K L G M N

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

L G T H N Y Q I V A T E G Y Q S S G S S

....|....|....|...

S I T V Q *

Chúng tôi sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích và so sánh trình tự giải mã được của xylB với các trình tự gen này đã công bố trên ngân hàng gen EMBL. Kết quả, đoạn gen đã được giải mã có độ dài 678 bp, mã hóa cho 205 amino acid (23 kDa). Như vậy, gen mã hóa xylanase được chuyển vào nấm sẽ là mã hóa enzyme xylanase thuộc họ 11. Đây là những enzyme rất đặc hiệu trong việc phân hủy xylan [13, 29]. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công Ti plasmid tái tổ hợp mang hai cấu trúc biểu hiện gen xylanase và gen kháng hygromycin B. Vector này còn được gọi là vector biểu hiện gen mã hóa xylanase.

3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph

3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens

Để tạo ra được nguyên liệu chuyển gen thực vật, Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph phải được chuyển vào một tế bào để làm ổn định nguồn gen. Hơn nữa, tế bào sinh vật này phải có khả năng chuyển gen quan tâm vào vật chủ mong muốn. Cho đến nay, chuyển gen nhờ Agrobacterium đã và đang được áp dụng rộng rãi trong chuyển gen vào thực vật và một số vi sinh vật chẳng hạn như nấm, vi khuẩn. Các nghiên cứu trên thế giới về thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong nấm thường sử dụng đoạn khởi đầu GpdA promoter. GpdA là một promoter đặc hiệu cho nấm. Promoter này có nguồn gốc từ A. nidulans và A. bisporus [22].

Phương pháp biến nạp được sử dụng phổ biến là sốc nhiệt tuy nhiên hiệu suất không cao bằng phương pháp xung điện. Hơn nữa vector biểu hiện có kích thước lớn do đó chúng tôi đã lựa chọn phương pháp xung điện để biến nạp vào A. tumefaciens và sử dụng chủng vi sinh vật này làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm sợi. Chủng A. tumefaciens được sử dụng là chủng có mang một loại plasmid trợ giúp (helper plasmid) mà trên plasmid có mang gen kháng ampicillin, plasmid này hỗ trợ chuyển T – DNA vào tế bào chủ, do đó trên môi trường chọn lọc cho A. tumefaciens, ngoài rifamycin, chúng tôi còn bổ sung thêm kháng sinh ampicillin để chọn lọc cho chủng có mang plasmid trợ giúp. Sau khi biến nạp, tế bào mang vector biểu hiện được chọn lọc trên môi trường YEB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin, ampicillin để chọn lọc A. tumefaciens và kanamycin để chọn lọc A. tumefaciens có mang plasmid tái tổ hợp.

3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium

Các dòng plasmid tái tổ hợp trước tiên được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn Kpn I. Các khuẩn lạc A. tumefaciens có chứa Ti-plasmid tái tổ hợp tạo được nhờ xung điện được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường đặc hiệu, tách chiết DNA plasmid và tiếp tục được biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành các thí nghiệm phân tích phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bước biến nạp trở lại DNA plasmid vào trong tế bào vi khuẩn E. coli vì số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp này trong tế bào Agrobacterium rất ít, không đủ để tiến hành các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của các kết cấu gen đưa vào.

Các plasmid dự đoán có mang vector biểu hiện pCB1300_xylB_hph được tinh sạch và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi nhân xylB và hph. Kết quả PCR trên hình 3. 16 cho thấy, chúng tôi đã đưa được plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph vào trong tế bào A. tumefaciens. Các dòng sau biến nạp được dùng làm nguyên liệu để chuyển vào nấm.

Hình 3. 16: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong Agrobacteirum bằng PCR

1–7: Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium

M: Marker 100 bp

Vì cấu trúc biểu hiện gen xylB đã được chuyển cùng với cấu trúc biểu hiện gen hph vào A. tumefaciens. Do vậy, dòng plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium tiếp tục được kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặt hiệu của gen hph.

Trên điện đồ (Hình 3. 17) sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng 0,6 kb. PCR là phương pháp đơn giản, hiệu quả và nhanh chóng để xác định chính xác cấu trúc của gen đã chuyển vào Agrobacterium.

1 2 3 4 5 6 7 M kb

Hình 3. 17: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong Agrobacteirum bằng PCR

1–7: Sản phẩm PCR của gen hph

M: Marker 100 bp

Như vậy, chúng tôi đã tạo được chủng Agrobacterium CV58C1 - pGV2260 mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph. Các dòng khuẩn lạc sau khi kiểm tra sẽ được lưu giữ để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm.

Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 -> 4150
123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18
123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV
123456789 -> Acknowledgements
123456789 -> Danh mục chữ viết tắT
123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung
123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo)
4150 -> LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng

tải về 4.32 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: