LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng
Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector trung gian
tải về 4.32 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.1.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pJET_hph
3.1.2. Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector trung gianCấu trúc (GluA promoter + xylB gene + TrypC terminator) đã được lắp ghép thành công vào vector trung gian, tạo thành vector tái tổ hợp pKS_xylB. Tuy nhiên, việc chọn lọc/ sàng lọc các thể tái tổ hợp thông thường cần sự có mặt của các gen chỉ thị như các gen kháng kháng sinh [20]. Trên cơ sở vector pAN7.1 – GluA nhận được từ Phòng Công nghệ sinh học enzyme, chúng tôi tiến hành thiết kế vector tái tổ hợp mang gen kháng kháng sinh (hph) để làm nguyên liệu lắp ghép tiếp vào vector trung gian. 3.1.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pJET_hphHph không thể lắp ghép trực tiếp vào vector trung gian vì theo chiến lược thiết kế vector đã đề ra, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B nằm trên vector trung gian sẽ được chuyển vào Ti plasmid bằng cách cắt mở vòng Ti plasmid và vector trung gian bằng enzyme Kpn I do không chọn được enzyme khác thích hợp. Do đó, hai đầu của đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và hph trên vector trung gian phải là vị trí nhận biết của Kpn I. Trên vector trung gian đã được ghép nối với xylB chỉ có một điểm cắt của Kpn I. Muốn xuất hiện điểm cắt thứ hai của Kpn I, chúng tôi phải chuyển qua một vector pKS– khác và tạo thành vector tái tổ hợp có kí hiệu pKS_hph. Trên vector pKS– cũng có điểm cắt của Kpn I, tuy nhiên nếu chuyển trực tiếp cấu trúc biểu hiện hph từ vector tái tổ hợp pKS_hph sang vector trung gian sẽ làm mất điểm cắt của Kpn I, hoặc vẫn chỉ có một điểm cắt của Kpn I và vector trung gian được tạo thành sẽ rất khó để tinh chế và nối ghép với Ti plasmid vector vì không có enzyme nào thích hợp cho cả hai vector trên. Do vậy, cấu trúc biểu hiện hph nằm trên vector tái tổ hợp pKS_hph được tách dòng bằng vector pJET1.2. * Lắp ghép hph vào vector pKS– Vector pAN – GluA được cắt bằng enzyme Sma I và Hind III để thu đoạn gen gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và nối ghép với vector nhận pKS– cũng được cắt bằng hai enzyme tương tự. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli. Các DNA plasmid sẽ được điện di trên gel agarose 0,8 % cùng với đối chứng âm (vector pKS– không có đoạn chèn), một số plasmid đại diện ở các mẫu cao hơn đối chứng âm được dùng để kiểm tra sự có mặt của hph bằng kỹ thuật PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của hph: hph1 và hph2. kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9  
Hình 3. 8: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph bằng kỹ thuật PCR M: Marker 100bp 1 – 9: sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp pKS_hph (kí hiệu pKS_hph (1 – 9) Sản phẩm PCR của tất cả các dòng khuẩn lạc đều xuất hiện một băng duy nhất có kích thước khoảng 0,6 kb (Hình 3. 8). Kích thước này phù hợp với kích thước lý thuyết. Do đó, chúng tôi khẳng định đã chuyển được hph vào vector pKS–. DNA của các dòng plasmid tái tổ hợp pKS_hph (1 – 3) được dùng làm khuôn để tổng hợp cấu trúc gen bao gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi M13. Sản phẩm PCR nhận được là cấu trúc gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và sản phẩm PCR được dùng làm đoạn chèn vào vector pJET1.2. * Lắp ghép hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2 Theo lý thuyết, sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi M13 với khuôn là DNA plasmid pKS_hph có kích thước khoảng 2,5 kb. 
~2,5kb kb 3 2,5
kb M 1 2 3 Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 -> 4150 123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18 123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV 123456789 -> Acknowledgements 123456789 -> Danh mục chữ viết tắT 123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung 123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo) 4150 -> LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng tải về 4.32 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|