LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng
Hình 3. 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng mồi M13 của các plasmid tái tổ hợp pKS
tải về 4.32 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.1.2.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph trong vector tái tổ hợp pJET_hph vào vector trung gian
- 3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph)
Hình 3. 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng mồi M13 của các plasmid tái tổ hợp pKS_hph 1 – 3: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pKS_hph (1–3)) M: Marker 1 kb Kết quả PCR bằng cặp mồi M13 (Hình 3. 9) thu được một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,6 kb. Sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme đầu bằng, do đó chúng tôi đã gắn vào vector tách dòng đầu bằng pJET1.2 của hãng Fermentas được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Vector này chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào có mang vector này mới có thể sống được trong môi trường có ampicillin. Đồng thời trên vector pJET1.2 còn chứa gen gây chết eco47IR mã hoá cho enzyme phân huỷ DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy vector gắn thêm đoạn ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa. Thêm vào đó, vùng MCS (Multiple Cloning Site) của vector có chứa điểm nhận biết của nhiều enzyme hạn chế như Kpn I, Xho I, Xba I…nhằm phục vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi đã tách dòng. Ngoài ra, trên vector mang trình tự hai mồi pJET1.2 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc xác định trình tự gen. Sản phẩm PCR của cấu trúc biểu hiện gen hph được tiến hành gắn với vector pJET1.2, sau đó biến nạp các sản phẩm nối ghép vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α (là loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến tại các phòng thí nghiệm vì chúng có khả năng tái bản cao). Các tế bào khả biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung amp (50 µg/ml) ở 37˚C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết DNA plasmid của các khuẩn lạc này. Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmid kích thước lớn hơn vector pJET1.2 (Hình 3. 10), chúng tôi đã xử lý enzyme giới hạn Sma I và Not I với 3 dòng khuẩn lạc pJET_hph (1 – 3).
Hình 3. 10: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET_hph mang cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) 1 – 23: DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu là pJET_hph (1 – 23) 24: Đối chứng – vector pJET1.2 Vì ghép nối GluA promoter + hph + TrypC ter vào vector pJET1.2, chúng đã được xử lý với enzyme Sma I và Not I nên điểm cắt của hai enzyme không bị mất đi, chúng trở thành điểm cắt ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai chèn vào vector pJET1.2. Trên điện di đồ (Hình 3. 11), sản phẩm cắt của các dòng tái tổ hợp pJET_hph (1 – 3) bằng enzyme Sma I và Not I đều gồm 2 đoạn tương ứng với hai băng có kích thước là 2,5 kb (kích thước của cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + gen hph + đoạn kết thúc TrypC) và 3 kb (kích thước của vecotr pJET1.2). Do đó, chúng tôi khẳng đã lắp ghép thành công cấu trúc biểu hiện gen kháng hygromycin B (GluA promoter + gen hph + TrypC ter) trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2. Plasmid tái tổ hợp pJET_hph được nuôi lượng lớn để dùng làm nguyên liệu cho thiết kế vector trung gian mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B pKS_xylB_hph. 
Hình 3. 11: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1_hph bằng cắt enzyme Sma I và Not I M: Marker 1 kb 1 – 3: Sản phẩm cắt của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pJET_hph (1 – 3) bằng Sma I và Not I 3.1.2.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph trong vector tái tổ hợp pJET_hph vào vector trung gianCấu trúc biểu hiện xylB đã được nối ghép vào vector trung gian mà không làm mất điểm cắt của Sma I và Not I. Hơn nữa, điểm cắt của Kpn I trên vector tái tổ hợp pJET_hph cũng sẽ không bị mất nếu cắt vector tái tổ hợp pJET_hph bằng enzyme Not I vì Not I nằm phía sau Kpn I. Do đó, vector tái tổ hợp pJET1.2 và vector trung gian được cắt bằng enzyme Sma I và Not I, sau đó nối ghép lại với nhau bằng T4 DNA ligase. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào E. coli. DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc đã được tách chiết và kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme. 3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph)Theo lý thuyết, khi xử lý vector trung gian đã mang cả hai xylB và hph bằng Kpn I, sản phẩm cắt thu được là hai đoạn có kích thước 6,4 kb và 3 kb, trong đó 6,4 kb là kích thước tương ứng với hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph và 3 kb là kích thước của vector pKS-. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 37°C trong 1,5 giờ. 
Hình 3. 12: Điện di sản đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pKS_xylB_hph bằng enzyme Kpn I DNA plasmid pKS_xylB_hph M: Marker 1 kb 2 – 3: Sản phẩm cắt của plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph(9, 18) bằng enzyme Kpn I Vì kích thước của sản phẩm cắt enzyme lớn, DNA plasmid được điện di cùng để làm đối chứng. Nhờ vậy dễ dàng phân biệt được sản phẩm cắt enzyme trong những trường hợp xử lý enzyme không hoàn toàn hoặc enzyme không hoạt động. Trên điện di đồ (Hình 3. 12), sản phẩm cắt enzyme của 2 dòng plasmid trên giếng số 2 và giếng số 3 gồm hai băng rất rõ nét. Một băng có kích thước khoảng 3 kb (kích thước của vector pKS–); một băng có kích thước 6,4 kb (kích thước của cả cấu trúc biểu hiện xylB và hph có trong vector trung gian). Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước lý thuyết. Để khẳng định chính xác trình tự được chuyển vào là trình tự xylB và trình tự hph, dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph9 được tiếp tực kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.
~ 0,7 kb ~ 0,6 kb
0,6 Hình 3. 13: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector trung gian pKS_xylB_hph9 M: Marker 100 bp 1: Sản phẩm PCR của hph 2: Sản phẩm PCR của gen xylB Sản phẩm PCR của xylB và hph rất đặc hiệu (Hình 3. 13) và có kích thước đúng bằng kích thước lý thuyết: xylB có kích thước khoảng 0,7 kb và hph có kích thước khoảng 0,6 kb. Do vậy, chúng tôi khẳng định đã thiết kế thành công vector trung gian pKS_xylB_hph mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph được nuôi lượng lớn để dùng cho các nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase.
Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 -> 4150 123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18 123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV 123456789 -> Acknowledgements 123456789 -> Danh mục chữ viết tắT 123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung 123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo) 4150 -> LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng tải về 4.32 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|