Hình 3. 2: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm tinh sạch của vector pAN7.1 – GluA và gen mã hóa

M: Marker 1 kb

1: Sản phẩm cắt của vector pAN7.1 – GluA bằng enzyme Bam HI

2: Sản phẩm cắt của gen mã hóa xylanase bằng enzyme Bgl II

Vector pAN7.1 – GluA được mở vòng bằng Bam HI nên sản phẩm cắt thu được trên điện di đồ (Hình 3. 2) là một băng duy nhất có kích thước khoảng 8,3 kb. Sản phẩm cắt enzyme của gen mã hóa xylanase có kích thước khoảng 0,7 kb. Hai đoạn DNA này có kích thước phù hợp với lý thuyết. Do đó, chúng sẽ được tinh sạch và nối ghép với nhau nhờ T4 DNA ligase. Do trình tự nhận biết điểm cắt của Bgl II tương đồng với trình tự cắt của Bam HI nên chúng có thể nối ghép dễ dàng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli để thu lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp.

Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào), sau đó phá màng tế bào bằng dung dịch II. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II còn có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg²⁺ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%.