Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma
Nuôi cấy tế bào phôi tâm (nucellar)
tải về 0.6 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.5.1. Sự phát triển của phôi nucellar
- 3.5.2. Nuôi cấy tế bào nucellar và sự hình thành phôi từ nucellar trong điều kiện in vitro
- 3.6.2.Phôi vô tính
3.5. Nuôi cấy tế bào phôi tâm (nucellar)Rangaswamy (1959) là người đầu tiên công bố nuôi cấy mô phôi tâm- nucellar ở Citrus. Khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung casein, tế bào nucellar C. microcarpa đã tạo mô sẹo, phân hoá mạnh thành “pseudobulbils” (dạng giả củ) và từ đó phát triển thành cây (Rangaswamy, 1959). Randhawa và cộng sự (1960) cũng tạo phôi thành công ở cây có múi đơn phôi C. grandis, C. limon và C. reticulata x C. sinensis. Không giống như C. microcarpa và C. reticulata, những cây con có nguồn gốc nucellar đã hình thành phôi một cách trực tiếp. Bitter và cộng sự (1963) đã mở rộng những nghiên cứu này sang các cây có múi không hạt, các cây đơn phôi và đa phôi như C. temple, C. reticulata, C. limon (chanh Meyer), C. maxima, C. sinensis (Robertson navel), C. latipes và C. latifolia (chanh không hạt). 3.5.1. Sự phát triển của phôi nucellarỞ một số giống Citrus, ngoài phôi hữu tính còn có các phôi không sinh ra từ tế bào túi phôi mà từ những tế bào soma của phôi tâm (nucellus) là lớp tế bào bao quanh túi phôi của hạt non. Sau khi tế bào trứng nằm trong túi phôi được thụ tinh và phân chia lần thứ nhất, ở phôi tâm có một số tế bào lớn với nhân to và nguyên sinh chất đậm đặc. Một số tế bào này bắt đầu phân chia, tạo khối nhỏ rồi dần dần hình thành phôi vô tính. Phôi vô tính phát triển song song với phôi hữu tính và còn được gọi là phôi nucellar (Toxopeus, 1930). Phôi nucellar phát triển bằng phân bào nguyên phân bình thường của tế bào nucellus, không có sự tham gia của tế bào sinh dục và không xảy ra phân bào giảm nhiễm như tế bào mẹ. Vì vậy, những cây con phát triển từ phôi nucellar thường giống hệt với cây mẹ về cấu trúc di truyền. Sự sinh sản vô tính này có ý nghĩa quan trọng đối với tiến hoá, chọn và tạo giống cây có múi. 3.5.2. Nuôi cấy tế bào nucellar và sự hình thành phôi từ nucellar trong điều kiện in vitroCác bước chuẩn bị nuôi cấy mô tế bào phôi tâm - nucellar in vitro như sau: 1. Bao kín nụ hoa vào ngày hoa nở để tránh sự pha tạp di truyền của mẫu cấy. 2. Khử đực và thụ phấn với phấn của cam ba lá (P. trifoliata). Lý do của việc thụ phấn có kiểm soát này là tạo ra sự đánh dấu khác biệt dễ nhận biết sau này. Vì tất cả cây con từ hợp tử (phôi hữu tính) sẽ mang lá ba thuỳ giống cây mẹ, khác với những cây có nguồn gốc nucellar. 3. Thu hạt từ quả non ở những thời điểm khác nhau (tuần) để xác định giai đoạn thích hợp nhất cho nuôi cấy. Việc lựa chọn thời gian thu mẫu thay đổi tuỳ theo từng giống. 4. Sau khi xác định thời điểm tối ưu nhất, hái những quả đang phát triển, rửa sạch, khử trùng bề mặt bằng hypoclorit canxi trong 10-15 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng ba lần. 5. Cắt đôi quả trong điều kiện vô trùng. Tách hạt non, bỏ vỏ lụa, lấy phần còn lại của hạt đem nuôi cấy hoặc cắt hạt non theo chiều dọc và quan sát dưới kính hiển vi soi nổi. Loại bỏ phôi hợp tử và nội nhũ. Gắp nucellus và đặt vào môi trường nuôi cấy. 6. Môi trường nuôi cấy tế bào nucellar là môi trường cơ bản MS bổ sung thêm auxin, cytokinin và các phụ gia khác như casein hydrolysate hay dịch chiết malt nếu cần, tuỳ thuộc vào loài được nuôi cấy (Bảng 16). 7. Mẫu cấy được giữ trong điều kiện nhiệt độ 25 oC, độ ẩm 50-60% và chế độ ánh sáng 16h sáng/ 8h tối trong ánh sáng khuếch tán (1000 - 1500 lux). 8. Khi mô sẹo hình thành, cấy chuyển sang môi trường (Murashige và Tucker, 1969). Thời gian giữa các lần cấy chuyển là 3- 4 tuần/ lần. 9. Các chồi hình thành sẽ được cấy chuyển sang môi trường chứa axit gibberellic (1- 5 mg/l). 10. Để kích thích sự hình thành rễ, có thể nuôi chồi trong môi trường lỏng thông qua cầu giấy lọc. 11. Cấy chuyển cây con có rễ phát triển tốt ra bầu (chậu) với hỗn hợp đất vô trùng và che túi nhựa để giữ ẩm. 12. Tuỳ thuộc vào sự phát triển của cây, cấy chuyển cây con ra nhà kính và đảm bảo độ ẩm cao trong 4 - 7 ngày và dần dần bỏ túi nhựa giữ ẩm ra. Bảng 3.4. Các chất bổ sung trong môi trường sử dụng để kích thích sự tạo phôi từ tế bào nucellar trong điều kiện in vitro
|
