Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma



tải về 0.6 Mb.
trang3/8
Chuyển đổi dữ liệu09.12.2017
Kích0.6 Mb.
#35026
1   2   3   4   5   6   7   8

3.3.1.2. Khử trùng nguyên liệu


Các nụ hoa chỉ sử dụng cho nuôi cấy trước khi bao phấn ở giai đoạn nứt ra. Các nhụy hoa (pistils) sau khi loại bỏ đài và tràng hoa, hoặc các bầu quả riêng rẽ, được khử trùng sơ bộ bằng cách rửa nhanh với EtOH 70%, khử trùng bề mặt bằng các tác nhân thích hợp, và cuối cùng rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Bầu quả sau đó được bóc vỏ cẩn thận bằng dao mổ, forcep, hoặc kim để lộ phần noãn gắn vào giá noãn. Giá noãn hoàn toàn, hoặc một phần của nó có mang noãn, được dùng trong thụ phấn giá noãn. Để thực hiện thụ phấn núm nhụy in vitro, các nhụy được tách rời và khử trùng cẩn thận bề mặt bằng dung dịch khử trùng và sau đó thấm khô núm nhụy.



Hình 3.2. Qui trình nuôi cấy bao phấn cây lúa

Phân lập hạt phấn ở điều kiện vô trùng, bao phấn được loại bỏ khỏi nụ hoa hoặc các hoa đã mở được giữ trong các đĩa petri có giấy lọc vô trùng cho tới khi nứt ra, các hạt phấn sau đó được đặt trong các noãn nuôi cấy, giá noãn hoặc núm nhụy tùy thuộc vào bản chất thí nghiệm. Nói chung, hạt phấn được đặt trực tiếp lên bộ phận nhụy nuôi cấy tốt hơn khi dàn trải trên môi trường chung quanh noãn.




3.3.1.3. Nuôi cấy noãn và bầu quả


- Noãn. Sinh trưởng của ống phấn gắn trên noãn trần (bare ovules) thường bị ức chế bởi sự có mặt của nước trên bề mặt của noãn. Màng nước này phải được làm khô bằng giấy lọc và sau đó, noãn khô ráo được phủ bằng hạt phấn. Các hạt phát triển từ các noãn có phôi hình cầu hoặc phôi già có thể dễ dàng phân biệt, một số kết quả đã đạt được ở Gynandrophát sinhis gynandra, Impatiens balsamina, Nicotiana tabacum và Allium cepa. Tuy nhiên, các noãn sau khi thụ phấn in vitro mang hợp tử đơn bào (single-celled zygote) cần các điều kiện sinh trưởng phức tạp hơn. Kỹ thuật cho các noãn tự thụ phấn hoặc thụ phấn chéo là giống nhau. Trong sự phát triển ở các giai đoạn phát sinh phôi tiếp theo thì noãn tự thụ phấn thường được giữ trên giá noãn cho tới khi tạo thành hạt, trong khi ngược lại noãn thụ phấn chéo cần giá noãn chỉ từ 6-8 ngày nuôi cấy đầu tiên. Sau đó, chúng có thể được chuyển tới môi trường nuôi không có giá noãn.
- Bầu quả. Kỹ thuật nuôi cấy bầu quả được phát triển bởi Nitsch (1951), ông đã nuôi thành công bầu quả tách từ các hoa thụ phấn in vitro để phát triển thành quả chín (Cucumis và Lycopersicum). Các quả này mang hạt có thể nảy mầm được nhưng chúng có kích thước nhỏ hơn các quả phát triển ở điều kiện tự nhiên. Các tác giả khác cũng đã nuôi cấy thành công các noãn tách rời từ một số loài (Linaria macroccana, Tropaeolum majus, Iberis amara, Hyoscyamus niger) trên môi trường chứa muối khoáng và sucrose. Bổ sung vitamin B vào môi trường giúp quả đạt kích thước bình thường và các hạt có thể nảy mầm được. Các môi trường nuôi cấy ngày càng giàu dinh dưỡng hơn do bổ sung IAA hoặc nước dừa, thậm chí cho quả có kích thước lớn hơn các quả hình thành trong điều kiện in vivo (Anethum graveolens).

Thành phần bao hoa như mày hoa và lá bắc có vai trò quan trọng trong sự phát triển của quả và phôi ở cây một lá mầm. Các bầu quả tách rời sớm sau khi đã thụ phấn của Triticum aestivum và T. spelta chỉ phát triển trong quá trình nuôi cấy khi bao hoa được duy trì nguyên vẹn. Nếu thiếu nhân tố này, sự tổng hợp DNA và kéo dài tế bào của các tế bào phôi lúa mạch có thể xảy ra nhưng sự phân chia tế bào không xuất hiện.





Hình 3.3 Qui trình nhân nhanh giống cây rừng bằng nuôi cấy phôi từ hạt

3.3.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro

3.3.2.1. Trạng thái sinh lý của mẫu vật


Trạng thái sinh lý của nhụy ở thời điểm tách rời noãn ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Bề mặt noãn hoặc núm nhụy (trong thụ phấn núm nhụy) ẩm ướt có thể ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt phấn hoặc phát triển của ống phấn và tiếp theo đó là hình thành hạt kém. Sự nảy mầm của hạt phấn trên núm nhụy và sự sinh trưởng của ống phấn dọc theo vòi nhụy có ảnh hưởng đến sự tổng hợp các protein, là các nhân tố đôi khi có thể ức chế hoàn toàn ống phấn trong bầu quả. Do đó, cần phải xác định bộ phận nào của nhụy tồn tại hàng rào ngăn cản. Để cải thiện khả năng thụ phấn in vitro, mức độ bất hợp phải được giảm xuống bằng cách tách bộ phận tổng hợp các protein ức chế và thụ phấn trực tiếp phần còn lại của nhụy dưới các điều kiện thí nghiệm.

Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Các noãn được tách ra sau khi nở hoa từ 1-2 ngày cho khả năng hình thành hạt cao hơn khi tách noãn vào ngày ra hoa. Ở ngô và bông, thụ phấn in vitro sau khi xuất hiện râu tơ từ 3-4 ngày cho kết quả tạo hạt tốt hơn.



3.3.2.2. Môi trường nuôi cấy


Maheshwari (1958) đã nuôi cấy thành công noãn trên môi trường dinh dưỡng bao gồm muối khoáng theo Nitsch, vitamin theo White , và 5% sucrose. Noãn của Papaver rhoeas và P. somniferum được tách 6 ngày sau khi thụ phấn (DAP- days after pollination) và thu được hợp tử hoặc tiền phôi có hai tế bào (two-celled proembryo) chứa một vài nhân nội nhũ (endosperm nuclei). Sinh trưởng của phôi ở giai đoạn đầu thấp hơn nhưng ngay sau đó ở giai đoạn hình cầu sinh trưởng nhanh hơn và đạt kích thước 0,93 mm so với 0,65 mm của phôi in vivo. Bổ sung kinetin và CH là cần thiết để kích thích sinh trưởng ban đầu của phôi. Một số noãn của hoa lan (orchids) được phân lập từ các bầu quả đã thụ phấn sinh trưởng tốt trên dung dịch đơn giản có sucrose 10%, nhưng noãn của Zephyranthes (mang một hợp tử và một nhân nội nhũ sơ cấp) cần bổ sung nước dừa hoặc casamino acid vào môi trường Nitsch. Ở Trifolium repens, noãn (1-2 DAP) phát triển thành hạt trưởng thành chỉ khi môi trường nuôi cấy được bổ sung dịch chiết các loại quả non như dưa chuột hoặc dưa hấu.

Trong nuôi cấy in vitro các noãn đã được thụ phấn ở hầu hết các loài thì môi trường Nitsch có cải biến được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, môi trường Steward và Hsu (S-H) thích hợp hơn cho nuôi cấy các thể lai cùng loài hoặc khác loài sau khi thụ tinh các noãn non . Môi trường nuôi cấy chứa IAA 10 µg/L hoặc kinetin 0,1 µg/L làm tăng số lượng hạt được tạo thành từ noãn. Nồng độ cao hơn của kinetin thường gây ức chế. Nguồn nitrogen (hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh) không ảnh hưởng đến tần số thụ tinh của các bầu quả của ngô được thụ phấn in vitro, nhưng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt .

Áp lực tthẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của noãn tách rời, noãn chứa các phôi hình cầu phát triển thành hạt trưởng thành trên môi trường chứa sucrose từ 4-10%, nhưng các noãn non đã được thụ tinh có một hợp tử và một vài nhân nội nhũ, hoặc các noãn vừa mới thụ tinh cần 6% và 8% sucrose.


3.3.2.3. Điều kiện nuôi cấy


Nói chung, nhiệt độ và ánh sáng có ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh trong ống nghiệm. Thông thường bước một của quá trình này xảy ra ở nhiệt độ phòng và không cần sự chiếu sáng đặc biệt. Chỉ ở giai đoạn sau, nuôi cấy bầu quả cần được duy trì ở 22-26oC và các điều kiện thích hợp khác có lợi cho phát sinh phôi. Sau khi thụ phấn trong ống nghiệm một vài ngày, một số noãn mở rộng, và ống phấn chui hoàn toàn vào trong túi phôi, cả phôi lẫn nội nhũ đều phát triển. Hiện tượng này có thể xác minh bằng các thí nghiệm tế bào-phôi học (cytoembryology).

Bảng 3.1. Môi trường Nitsch-sử dụng phổ biến trong nuôi cấy các noãn thụ phấn in vitro


Thành phần

Nồng độ (mg/L)

Thành phần

Nồng độ (mg/L)

CaNO3


500

FeC6O5H7.5H2O

10


KNO3

125

Glycine

7,5

KH2PO4

125

Ca-pantothenate

0,25

MgSO4.7H2O

125

Pyridoxine HCl

0,25

CuSO4.5H2O

0,025

Thiamine HCl

0,25

Na2MoO4

0,025

Niacin

1,25

ZnSO4.7H2O

0,5

Sucrose

50000

MnSO4.4H2O

3

Agar

7000

H3BO3

0,5




















Bảng 3.2. Môi trường Steward và Hsu (S-H)-nuôi cấy các thể lai cùng loài và khác loài từ các noãn non được thụ tinh


Thành phần

Nồng độ (mg/L)

Thành phần

Nồng độ (mg/L)

KHả NĂNGO3


5055



KI

8,6

NH4NO3

1200

MnSO4.4H2O

0,83

KH2PO4

272

H3BO3

16,9

MgSO4.7H2O

493

Acid nicotinic

6,18

CaCl2.2H2O

441

Pyridoxine HCl

0,49

FeSO4.7H2O

8,3

Thiamine HCl

0,82

Na2-EDTA

11

Inositol

1,35

CuSO4.5H2O

0,025

D-Fructose

180

CoCl2.6H2O

0,024

Sucrose

3600

Na2MoO4.2H2O

0,24

IAA

40000

ZnSO4.7H2O







5  10-5 mol/L















Bảng 3.3. Môi trường Gengenbach có hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh-cần thiết cho sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt ngô


Thành phần

Nồng độ

Thành phần

Nồng độ

KH2PO4

3750*

Threonine

198**

MgCl2.6H2O

1500*

Serine

347**

CaCl2.2H2O

1200*

Glutamate

1761**

CuSO4.5H2O

0,1*

Proline

621**

CoCl2.6H2O

0,1*

Alanine

476**

Fe-EDTA

50*

Cystein

160**

Na2MoO4.2H2O

1*

Valine

330**

ZnSO4.7H2O

10*

Methionine

117**

KI

5*

Isoleucine

237**

MnSO4.4H2O

100*

Leucine

1009**

H3BO3

100*

Tyrosine

262**

Glycine

168**

Phenylalanine

387**

Thiamine HCl

0,4**

Lysine

88**

Acid folic

0,044**

Histidine

164**

Niacin

1,2**

Arginine

150**

Sucrose

150***

Asparagine

300**

IAA




Glutamine

292**

Agar

5,5***

Tryptophan

204**

Aspartate

500**




















Chú thích: * : µmol/L, ** : mg/L, *** : g/L

3.3.2.4. Kiểu gen


Phản ứng của bầu quả in vitro trong mối liên quan với sự hình thành hạt tùy thuộc vào từng loài. Hạt phấn của các loài họ cải khó nảy mầm trong nuôi cấy và người ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp bằng cách nhúng noãn của Brassica oleracea trong dung dịch CaCl2 1%, sau đó gieo chúng trên một lớp gelatin 10% mỏng (10 µm) rồi thụ phấn với hạt phấn. Lớp gelatin mỏng được bảo quản trong đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp. Sau 24 giờ nuôi, noãn được thụ tinh và chuyển lên môi trường Nitsch có agar cho tới khi tạo hạt.

3.3.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro


Được ứng dụng ít nhất ở 3 lĩnh vực: vượt qua sự tự bất hợp (self-in compability), vượt qua sự bất hợp khi lai (cross-inuôi cấyompability) của các giao tử và sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis).

Các loài Petunia axillaris và P. hybrida là tự bất hợp. Hạt phấn nảy mầm tốt trên nhụy được tự thụ phấn nhưng tồn tại một hàng rào ngăn cản ở trong bầu quả đã cản trở sự phát triển của ống phấn, làm cho ống phấn không thể thụ tinh với noãn. Các hàng rào trong các taxon này có thể được vượt qua bằng sự thụ phấn in vitro và sự hình thành hạt xuất hiện bình thường. Ở loài P. axillaris tính bất hợp cũng có thể vượt qua nhờ sự thụ phấn nụ hoa in vivo (in vivo bud pollination).

Nuôi cấy thành công các noãn được thụ phấn in vitro đã tăng khả năng sản xuất các thể lai. Lai cùng loài (intraspecific), khác loài (interspecific), khác chi (intergeneric) và khác họ (interfamilia) cũng đã được tiến hành thông qua sự thụ phấn giá noãn và noãn in vitro. Một ứng dụng khác của thụ phấn in vitro là sản xuất các thể đơn bội của Mimulus luteus cv. Tigrinus grandiflorus bằng cách thụ phấn các noãn tách tời của nó với Torenia fournieri. Thể đơn bội của M. luteus phát triển bằng trinh sản. Sự phát triển bằng trinh sản như thế của các thể đơn bội trong nuôi cấy từ các noãn được thụ phấn nhưng không thụ tinh đã được thông báo ở các loài Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum và Triticum aestivum.


Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào

tải về 0.6 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5   6   7   8




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương