Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma
Nhân giống cây trồng qua nuôi cấy phát sinh phôi
tải về 0.6 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 3.4.1.2. Nuôi cấy phôi trưởng thành
- 3.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy
- 3.4.2.2. Phân lập phôi
- 3.4.2.3. Môi trường dinh dưỡng
- 3.4.3. Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi
- 3.4.3.2. Phát sinh callus
3.4. Nhân giống cây trồng qua nuôi cấy phát sinh phôi3.4.1. Các kiểu nuôi cấy phôi3.4.1.1. Nuôi cấy phôi nonKiểu nuôi cấy này được dùng chủ yếu cho các phôi non có nguồn gốc từ các hạt lai hoặc hạt non không thể nảy mầm. Tách các phôi như thế là rất khó khăn và môi trường nuôi cấy chúng rất phức tạp. Cơ hội thành công của loại nuôi cấy này phụ thuộc rất lớn vào giai đoạn phát triển của phôi phân lập. 3.4.1.2. Nuôi cấy phôi trưởng thànhCác phôi trưởng thành được tách ra từ các hạt chín và nuôi cấy, chủ yếu để tránh sự ức chế trong hạt đối với sự nảy mầm. Kiểu nuôi cấy này tương đối dễ dàng vì phôi chỉ cần môi trường dinh dưỡng đơn giản chứa muối khoáng, đường và agar để sinh trưởng và phát triển. Để thu được phôi ở tuổi đặc biệt, thì sự thụ phấn nhân tạo các hoa là rất cần thiết và người ta có khả năng xây dựng mối quan hệ giữa các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của sự phát triển phôi với DAP. 3.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy3.4.2.1. Khử trùng bề mặtPhôi của thực vật có hạt thường phát triển bên trong noãn được bao bọc bởi bầu quả. Vốn ở chúng đã tồn tại sẵn một môi trường vô trùng do đó khử trùng bề mặt phôi là không cần thiết trừ khi vỏ hạt bị tổn thương hoặc xuất hiện sự nhiễm hệ thống. Vì thế các hạt trưởng thành, noãn nguyên vẹn, hoặc quả được khử trùng bề mặt và các phôi vô trùng tách khỏi các mô chung quanh. Khử trùng bề mặt được tiến hành bằng cách ngâm nguyên liệu vào trong dung dịch khử trùng thương mại có hypochlorite (Clorox 5-10%, sodium hoặc calcium hypochlorite 0,45%) trong 5-10 phút hoặc EtOH (70-75%) trong 5 phút. Nồng độ thấp của các chất hoạt dịch (surfactant) như Tween 20, Tween 80, Teepol, hoặc Mannoxol được bổ sung vào dung dịch khử trùng làm tăng tính thấm của mô. Đối với hạt ngô, và các phôi tách rời: ngâm trong EtOH 70% cộng với 5-10 phút khử trùng bằng sodium hypochlorite 2,6%. 3.4.2.2. Phân lập phôiPhân lập phôi phải thực hiện ở điều kiện vô trùng dưới laminar (laminar air flow hood). Phôi trưởng thành phân lập tương đối dễ bằng cách giải phẩu hạt. Ngâm hạt có vỏ cứng (Iris, Cyclamen) trong nước từ một vài giờ đến một vài ngày trước khi khử trùng để giải phẩu nó được dễ dàng hơn. Phân lập các phôi nhỏ hơn hoặc phôi non đòi hỏi giải phẩu phải đặc biệt cẩn thận nếu chúng được bọc trong nội nhũ dạng lỏng. Trong trường hợp như thế cần mở rãnh ở đầu lỗ noãn của noãn non và gây áp lực gây ở đầu đối diện để thu được phôi thông qua rãnh nứt. 3.4.2.3. Môi trường dinh dưỡngNhu cầu dinh dưỡng của phôi trong quá trình phát triển in vivo chia làm hai pha: pha dị dưỡng (heterotrophic phase)-pha sớm, ở pha này phôi nhận chất dinh dưỡng từ nội nhũ và pha tự dưỡng (autotrophic phase)-pha muộn, ở pha này phôi có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho sinh trưởng của chúng. Giai đoạn phôi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng khác nhau tùy loài. Thành phần môi trường cho sinh trưởng của phôi non hoặc chưa trưởng thành khác với phôi trưởng thành. Monnier (1976), đã xây dựng phương pháp cho phép phát triển hoàn chỉnh phôi non ở Caphát sinhella (giai đoạn hình cầu sớm) cho đến khi nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí nuôi cấy đầu tiên trong đĩa petri. Theo hướng này, Không và cs (1983) cũng thu được sự sinh trưởng liên tục của các phôi chưa trưởng thành ở lúa. 
Hình 3.4. Phương pháp nuôi cấy phôi non cho đến khi nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí nuôi cấy đầu tiên trong đĩa petri. a. Muối khoáng Các chất dinh dưỡng của môi trường MS, B5 và White có cải biến nhất định được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm nuôi cấy phôi. Chẳng hạn, môi trường nuôi cấy phôi của Caphát sinhella có nồng độ potassium cao hơn (bổ sung 350 mg/L KCl) và nồng độ calcium (CaCl2) gấp đôi, nồng độ của NH4NO3 và Fe-EDTA giảm gần một nửa, còn nồng độ các muối vi lượng theo MS là gấp đôi. b. Nguồn carbon Sucrose là nguồn carbon chủ yếu được sử dụng để cung cấp năng lượng cho phôi nuôi cấy in vitro. Trong nuôi cấy phôi của một số loài (ví dụ: ngô) có thể cần bổ sung maltose, lactose, raffinose, hoặc mannitol. Một số loài thuộc họ Rosaceae và các loài lai thuộc chi Lilium bổ sung glucose tỏ ra có ưu thế hơn sucrose. Phôi của Heracleum spondylum sinh trưởng hiệu quả trên môi trường chứa glucose, fructose, galactose, mannose, hoặc mannitol. Glucose cũng cần thiết cho sinh trưởng của rễ ở phôi Ginkgo trưởng thành. Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dưỡng, còn có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường (phải lưu ý đến tuổi phôi). Phôi trưởng thành sinh trưởng khá tốt ở nồng độ sucrose thấp nhưng các phôi non hơn thường đòi hỏi nồng độ của carbonhydrate cao hơn. Nói chung, các nồng độ khác nhau của sucrose dùng trong nuôi cấy phôi phụ thuộc vào loài và kích thước/tuổi của phôi.
Phôi có một hệ thống enzyme rất tốt có thể biến đổi nitrite thành nitrate và sau đó thành amonium. Amonium nitrate có ưu thế quan trọng hơn so với KNO3, NaNO3 và (NH4)2HPO4. Sự có mặt của ion NH4+ rất cần thiết cho sinh trưởng và phân hóa của phôi. Các amino acid khác nhau và các amide của chúng đã được thử nghiệm cho nuôi cấy phôi. Một số tác giả cho rằng asparagine tăng khả năng sinh trưởng của phôi, nhưng những tác giả khác lại thấy glutamine là nguồn nitrogen có ưu thế sinh trưởng cho phôi của một số loài (ví dụ: Caphát sinhella bursa-pastoris, Arabidophát sinhis thaliana, Reseda odorata) còn asparagine lại ức chế mạnh sự sinh trưởng của chúng. Các amino acid khác có tác dụng kích thích hoặc ức chế. Dịch thủy phân casein (CH), một phức hợp amino acid, được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào các môi trường nuôi cấy phôi. Nồng độ CH tối ưu cho Hoderum vulgare khoảng 500 mg/L, trong khi phôi Datura tatula sinh trưởng ở nồng độ CH 50 mg/L. Các amino acid, CH và các amide có thể được khử trùng bằng autoclave và cùng với các chất dinh dưỡng của môi truờng. d. Dịch chiết thực vật tự nhiên Nếu môi trường được bổ sung thêm nước dừa không khử trùng bằng autoclave, các phôi này sẽ tăng chiều dài nhưng không có dấu hiệu nảy mầm sớm. Nhiều tác giả gợi ý rằng sự có mặt của “nhân tố phôi” (embryo factor) trong nội nhũ dạng lỏng của nước dừa có thể thay thế cho sự thiếu hụt đường, amino acid, các hormone sinh trưởng và các chất khác trong môi trường nuôi cấy. Nước dừa có hiệu quả kích thích sinh trưởng của phôi non tách rời của mía đường, lúa mạch, cà chua, cà rốt và các loài dương xỉ. Các dịch chiết tự nhiên từ các phần của mô ở các loài thực vật có thể kích thích sinh trưởng phôi và ức chế nảy mầm sớm của phôi lúa mạch chưa trưởng thành bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch chiết chuối, dịch chiết quả chà là, dịch thủy phân lúa mì-gluten và dịch chiết cà chua. Các dịch chiết này có hiệu quả tương tự nước dừa. Dịch chiết của Datura và Sechium cũng có hiệu quả như nước dừa, nhưng dịch chiết từ hạt Lupinus lại có hiệu quả gấp đôi. Người ta đã cố gắng thay thế các “nhân tố phôi” của nước dừa bằng các hóa chất xác định. Để kích thích sự sinh trưởng của tiền phôi lúa mạch, nước dừa có thể được thay thế bằng môi trường White giàu phosphate bổ sung thêm hai amino acid chính là glutamine và alanine và năm amino acid khác có vai trò như là nguồn cung cấp nitrogen, ở pH 4,5. Tỷ lệ sống sót của phôi tăng lên khi nồng độ của KCl, KNO3 và các thành phần hữu cơ nhất định tăng lên từ 5-10 lần. e. Các chất điều khiển sinh trưởng Auxin và cytokinin không được sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm ứng tạo callus. Ở nồng độ rất thấp (0,01 mg/L) GA kích thích phát sinh phôi của phôi non lúa mạch mà không cần cảm ứng nảy mầm sớm, và kích thích sinh trưởng ở các phôi tách rời dạng hình tim của Phaseolus. Cũng có một số kết quả cho rằng ABA có hiệu quả tương tự trên phôi lúa mạch và Phaseolus. f. pH môi trường Các phôi tách rời sinh trưởng tốt trên môi trường có pH 5,0-7,5. Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6,0). Nói chung pH môi trường được điều chỉnh 0,5 đơn vị cao hơn giá trị pH mong muốn để bù đắp cho sự thay đổi không thể điều chỉnh trong quá trình khử trùng. g. Điều kiện nuôi cấy Nói chung nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Một đôi khi nhiệt độ tối ưu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng một loài. Các loài Zamia, Phaseolus, bông thích hợp với nhiệt độ ấm (27-30oC), trong khi nhiệt độ nuôi cấy phôi của các loài lai ở Brassica, lúa, lúa mạch thích hợp từ 17-22oC. Trước đây, nhiều tác giả cho rằng ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng của phôi in vitro, nhưng những nghiên cứu gần đây khi nuôi cấy phôi chưa trưởng thành của lúa mạch, lanh, loài lai Aegilopst × Hordeum, và các cá thể lai khác loài của Allium lại tiến hành trong tối trước khi chuyển chúng sang điều kiện sáng để nảy mầm. Các phôi sơ cấp dạng hình tim của các loài Ilex mẫn cảm với ánh sáng. Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng trong suốt 4 ngày nuôi đầu tiên. Nhiều tác giả cho rằng nuôi trong tối ở giai đoạn ban đầu (bốn ngày) là rất cần thiết theo đó chúng có thể sinh trưởng tới giai đoạn trưởng thành thậm chí dưới điều kiện chiếu sáng liên tục.
3.4.3.1. Môi trường dinh dưỡngCác môi trường dinh dưỡng đang sử dụng hiện nay thường có áp suất thẩm thấu thấp hơn dịch noãn được nuôi cấy trên môi trường đó. Rất có thể môi trường không hoàn toàn thích hợp. Vì vậy, người ta đã tìm cách sử dụng dịch chiết xuất từ nội nhũ để đưa ra một công thức môi trường thích hợp hơn, chẳng hạn: - Môi trường dinh dưỡng. - Nội nhũ khoẻ. - Phôi lai. Nội nhũ khỏe có thể cung cấp cho phôi lai những chất cần thiết. Cây cho nội nhũ có thể là những loài khác nhau của cùng một chi.
Ternovsky và cs (1976) đạt được một kết quả lý thú là thu được cây thuốc lá có tính chống chịu mới khi nuôi phôi từ hạt lai không nảy mầm. Каталог: Data -> News -> 388 -> files News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn files -> Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào tải về 0.6 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|