Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào

tải về 1.2 Mb.

trang	4/6
Chuyển đổi dữ liệu	02.12.2017
Kích	1.2 Mb.
	#34923

1 2 3 4 5 6

Phòng thí nghiệm

2.4.1. Các thiết bị , dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thường bao gồm:

-Phòng rửa dụng cụ

-Phòng chuẩn bị môi trường, hấp tiệt trùng và chứa dụng cụ

- Phòng cấy vô trùng

- Phòng nuôi mẫu

- Phòng quan sát và thu nhận số liệu

Sơ đồ tổng quan như sau:

1.Phòng rửa và sản xuất nước cất

2. Phòng sấy hấp, kho thủy tinh sạch

3. Phòng chuẩn bị môi trường

4. Phòng chuẩn bị mẫu

5. Phòng cấy vô trùng

6. Phòng ảnh

7. Phòng kính hiển vi

8. Phòng nuôi

9.Phòng nuôi

10. Phòng sinh hóa

Bên cạnh phòng thí nghiệm cần có hệ thống nhà lưới và vườn ươm để trồng cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và trồng cây tái sinh trong quá trình chọn lọc ìnvitro.

a. Phòng rửa và cất nước:

Phòng rửa dụng cụ phải có bồn rửa lớn , có đường thoát nước riêng cho axit, có kệ để các thiết bị:

- Máy cất nước một lần

- Máy cất nước hai lần

- Máy sản xuất nước khử ion

b.Phòng sấy hấp:

- Tủ sấy 60-600⁰C (loại có dung tích lớn)

- Nồi áp suất loại nhỏ (20-30 lít)

- Nồi áp suất loại lớn (70-100 lít)

c.Phòng chuẩn bị môi trường:

- pH meter

- Máy khuấy từ

- Cân phân tích 10^-4g

- Cân kỹ thuật 100^-2g

- Máy rót môi trường

- Bếp điện

- Microwave

- Tủ lạnh 100-200 l

- Tủ lạnh sâu (-20 đến -80⁰C)

d. Phòng cấy vô trùng

Phòng cấy vô trùng nên là một phòng nhỏ, kín, sàn và tường cần được lát gạch men hoặc sơn để lau chùi và khử trùng thường xuyên. Cửa phòng cấy nên là cửa kính vì trong khi thao tác cấy rất dễ bị phụt đèn cồn do đó cần phải dễ liên lạc với bên ngoài trong lúc cần thiết. Trên tường gắn đèn UV để khử trùng phòng.

Có hai loại tủ cấy thường được sử dụng: tủ cấy tĩnh và tủ cấy thổi khí vô trùng. Trong tủ cấy phải có đèn trắng để dễ làm việc và có đèn UV để khử trùng trước khi làm việc

- Laminar

-Quạt thông gió

- Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường

- Thiết bị lọc không khí

- Giá và bàn để môi trường

- Bộ dụng cụ cấy, đèn cồn…

e. Phòng nuôi mẫu cấy:

Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng, độ ẩm, độ dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp.

Phòng nuôi có nhiệt độ 15-30⁰C tùy theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm. Nhiệt độ phải được phân bố đều trong toàn phòng nuôi, phải có đầy đủ ánh sáng huỳnh quang và có thể điều khiển được cường độ và thời gian chiếu sáng. Phòng nuôi phải được thổi khí đồng nhất và biên độ độ ẩm được điều chỉnh từ 20-98%.

- Phòng nuôi sáng: tường nên sơn màu trắng. Các giá đèn được lắp đèn ống để chiếu sáng. Trong phòng cần gắn các máy móc kiểm tra chính xác nhiệt độ, độ ẩm.

- Phòng nuôi tối để nuôi mô sẹo và các xử lí đặc biệt. Phòng cần tất cả các điều kiện như phòng sáng chỉ khác là không cần lắp đèn chiếu sáng cho cây, cửa sổ cần được che kín bằng vải đen.

- Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.

- Máy điều hòa nhiệt độ

- Máy lắc nằm ngang 100-200 vòng/phút

- Các thiết bị và dụng cụ nuôi cấy tế bào đơn

-Tủ ấm.

f. Phòng sinh hóa :

Phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền.

- Tủ hút, tủ ấm

- Cân các loại

- Máy cắt tiêu bản

- Máy đo pH

- Ly tâm lạnh

- Máy điện di, máy soi AND

- Máy PCR,máy sắc kí,quang phổ

- Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu

- Lò vi sóng

- Pipet tự động các loại

- Máy soi và chụp ảnh gel

-Các tủ đựng hóa chất, tủ hút khí độc.

* Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: có 3 nhân tố chính:

- Đảm bảo điều kiện vô trùng.

-Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

- Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.

2.4.2. Các thủ tục cơ bản trong phòng thí nghiệm:

2.4.2.1. Cân

Việc chuẩn bị môi trường đòi hỏi thao tác cân phải chính xác. Trước hết cân phải được đặt ở vị trí ổn định, không bị rung, không khí không bị dao động nhiều. Cân và dĩa cân phải được giữ gìn sạch sẽ. Quan trọng nhất là không được cân qúa trọng lượng cho phép và nên sử dụng các vật đựng hóa chất có trọng lượng nhỏ hoặc bằng giấy khi cân. Không được để hóa chất tiếp xúc trực tiếp với mặt cân.

2.4.2.2. Đong chất lỏng

Các dụng cụ thủy tinh có chia vạch (ống hút có chia độ, cốc thủy tinh có chia vạch, ống đong) cần thiết để pha môi trường. Ống đong có thể tích 10,20,100 và 1000ml được sử dụng để đong những chất lỏng có thể tích lớn còn ống hút có chia độ, bình định mức dung để đong những thể tích cần chính xác. Đong các dung dịch chỉ chính xác khi đáy của không khí ngang với vạch đánh dấu.

2.4.2.3. Xác định độ pH

Độ pH của môi trường cấy hầu hết được chỉnh ở 5,5 +-0,1 trước khi hấp khử trùng. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Vì vậy xác định chính xác độ pH là cần thiết. Murashige và Shoog nhận thấy rằng pH 5,7-5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS. Nếu môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5, môi trường cấy huyền phù có pH thấp phần nào giảm bớt tính trạng nhiễm.

Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl sau khi đã pha xong môi trường và chuẩn bị đưa và hấp khử trùng. Có thể chỉnh pH bằng pH kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giây đo pH. Thường thì nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính axit của môi trường. Mann và cộng sự nhận thấy rằng nếu trước khi hấp pH=5,7 thì sau khi hấp pH =5, Nếu muốn pH =5,7-5,9 thì trước khi hấp khử trùng cần điều chỉnh pH đến 7.

2.4.2.4. Rửa dụng cụ thủy tinh và bình nuôi cấy bằng plastic

Thông thường bình nuôi cấy sau khi sử dụng cần phải được rửa kỹ bằng xà bông bột cho hết các chất bám trên thành chai rồi tráng lại nhiều lần bằng nước sạch cuối cùng tráng lại bằng nước cất. Các dụng cụ thủy tinh bị quá bẩn cần phải được ngâm trong axit HCl hoặc sulfuric sau đó rửa sạch bằng nước máy và tráng bằng nước cất. Các bình môi trường bị nhiễm trùng trong quá trính nuôi cấy cần phải được hấp tiệt trùng trước khi rửa. Các dụng cụ thủy tinh sau khi rửa phải được sấy khô trong tủ sấy và được cất cẩn thận.

2.5. Đảm bảo điều kiện vô trùng

2.5.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.

Thông thường một chu kì nuôi cấy mô và tế bào thực vật dài từ 1-5 tháng, trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một vài ngày. Như vậy mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, điều kiện này đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor.

Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.

- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn.

- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường.

2.5.2.Khử trùng

2.5.2.1. Khử trùng phòng cấy và tủ cấy

Phòng cấy thường là phòng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m², có hai lớp của để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường được lát gạch men để dễ lau chùi. Trước khi đưa vào sử dụng buồng cấy cần được xử lí bằng hơi Formol bằng cách rót formaldehyde (formalin)4% ra một số dĩa petri để rãi rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự nhiên. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde dư bằng dung dịch NH₃ 25% trong 24 giờ. Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo..Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và một cốc đựng cồn 95% để nhúng dụng cụ làm việc

Trước khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90⁰. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử ngoại treo trên trần.

Phòng cấy lớn được khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực tím.Thời gian khử trùng tùy theo kích thước của phòng và đèn cực tím chỉ được sử dụng khi không có người. Phòng cũng có thể được khử trùng bằng cách lau rửa hai lần/tháng với các dung dịch chống nấm. Phòng nhỏ hơn và tủ cấy cũng được khử trùng bằng tia cực tím hay các dung dịch khử trùng. Tủ cấy thổi gió được khử trùng bằng cách mở quạt gió và lau tất cả các bề mặt bằng cồn 95% trong 15 phút trước khi bắt đầu làm việc.

Phòng nuôi cũng được khử trùng trước hết là bằng xà bông bột. Sau đó lau bằng dung dịch hypoclorit sodium 2% hoặc bằng cồn 95%. Tất cả sàn, trần đều được lau như vậy mỗi tuần. Cẩn thận không nên khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử.Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại ra vào buồng cấy nhiều lần.

2.5.2.2. Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác

a. Dụng cụ:

Dụng cụ thủy tinh dung cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là bình thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ bình thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.

Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường chỉ cần xử lí bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng nhiều lần bằng nước máy cuối cùng tráng bằng nước cất. Sauk hi để ráo nước dụng cụ thủy tinh cần được vô trùng bằng cách sấy ở 160⁰C/giờ. Sau khi nguội được lấy ra cất vào chỗ ít bụi.

Dụng cụ kim loại, giấy nhôm… cần được khử trùng bằng không khí nóng (130-170⁰C) trong 2-4 giờ trong tủ sấy. Tất cả các vật dụng này phải được gói kín trước khi khử trùng nhưng không được gói bằng giấy vì giấy bị phân rã ở 170⁰C. Không nên hấp khử trùng dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm cho kim loại bị rỉ sét và bị ăn mòn.

Trước khi sử dụng các dụng cụ đã được khử trùng bằng không khí nóng, các dụng cụ được lấy ra khỏi giấy gói, nhúng vào cồn 95⁰ và đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Sauk hi dùng xong, dụng cụ này phải được đốt lại bằng cồn trước khi sử dụng tiếp. Khi sử dụng cồn cần lưu ‎y đến sự an toàn tối đa vì rất dễ bị phụt.

Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới áp suất nhất định.Nút gòn, vải, các dụng cụ thủy tinh, bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, pipet, nước, môi trường khoáng… đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Gần như tất cả vi sinh đều bị chết bởi hơi nước trong nồi hấp trong 10-15 phút ở 121⁰C.

b. Nút đậy:

Thường dùng nhất là nút đậy làm bằng bông không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trính nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có nhược điểm sau:

+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ bị nhiễm nấm nhất là các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài.

+Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn.

+ Chỉ dùng được một vài lần sau phải bỏ.

Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác nhau để thay thế nút bong. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp ở 120⁰C mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm sử dụng nắp inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vôt trùng.

Các dung dịch mẹ dùng để pha chế môi trường (dung dịch muôi khoáng, vitamin..) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch vitamin nên chia thành nhiều loại nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường chỉ nên dùng các lọ có dung tích 100-200 ml.

c. Khử trùng môi trường khoáng:

Để khử trùng môi trường khoáng thường sử dụng hai phương pháp hấp tiệt trùng và lọc bằng màng lọc vô trùng. Môi trường nuôi cấy, nước cất và các hóa chất ổn định khác có thể chứa trong bình thủy tinh và đậy bằng nút gòn, giấy nhôm hoặc nắp nhựa. Tuy nhiên môi trường có các chất không bền nhiệt thì cần sử dụng phin lọc milipore. Nói chung môi trường khoáng được hấp tiệt trùng ở 121⁰C, 1 atm. Với những thể tích nhỏ (100 ml hoặc ít hơn) thời gian khử trùng là15-20 phút. Với lượng môi trường lớn thì phải khử trùng trong 30-40 phút. Áp suất không nên cao quá 1 atm vài áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ

Bảng 2.1 . Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 121⁰C (Burgerr, 1988)

Thời gian khử trùng tối thiểu (phút)	Thể tích môi trường (ml)
24	20-25
26	50
28,5	100
31,5	250
35	500
40	1000
48	2000
55	3000
63	4000

Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone..không bền nhiệt vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng. Phin lọc milipore hoặc phin lọc seitz đều có thể sử dụng với kích thước lỗ không lớn hơn 0,2 m. Các bình đựng thủy tinh cần phải được hấp tiệt trùng trước khi lọc.

Môi trường khoáng có chất không bền nhiệt có thể được tiến hành chuẩn bị theo các bước sau: đầu tiên các chất khoáng bền với nhiệt độ được hấp tiệt trùng, sau đó làm lạnh xuống còn 50-60⁰C trong điều kiện vô trùng khi đó những chất không bền với nhiệt độ sẽ được lọc vô trùng. Dung dịch đã khử trùng này sẽ phối hợp với nhau trong điều kiện vô trùng để tạo ra một môi trường hoàn chỉnh

2.5.2.3.Khử trùng mẫu cấy thực vật

Các loại mẫu cấy thường được sử dụng trong nuôi cấy mô

Về mặt nguyên tắc, các tế bào còn sống đã phân hóa đều có khả năng phản phân hóa trở lại trạng thái trẻ hóa và tái lập khả năng phân chia. Tuy nhiên có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển mạnh (mô phân sinh ngọn, tượng tầng…) khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo cao. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú y đến chồi nách và mô phân sinh ngọn.Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là:

Đỉnh sinh trưởng thân, rễ
Chồi bên
Tượng tầng
Vảy củ
Chồi ngọn
Nhu mô lá, nhu mô vỏ thân
Chồi nảy từ củ

Cần biết là tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể cho các mô sẹo phát triển khác nhau với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy khi khởi đầu chọn giống, nhân giống một cây cụ thể trước hết cần tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khác nhau.

Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.

Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng

Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Khi xử lí xong mô cấy được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú y để lại một lớp bọc ngoài khi ngân mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường.

Đối với những mẫu khó khử trùng thì việc xử lí mẫu phải được lặp lại sau 24-48 h trước khi cấy. Điều này cho phép những vi sinh vật chưa chết có thời gian phát triển đến giai đoạn nhạy cảm với thuôc khử trùng.
Bảng 2.2. Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử lí mô cấy thực vật

Stt	Chất khử trùng	Nồng độ	Thời gian khử trùng (phút)	Hiệu quả
1	Hypochlorite calcium	9-10%	5-30	Rất tốt
2	Hypochlorite sodium	0,5-5%	5-50	Rất tốt
3	Nước bromine	1-2%	2-10	Rất tốt
4	Oxy già	3-12%	5-15	Tốt
5	Chlorua thủy ngân	0,1-1%	2-10	Tốt
6	Nitrate bạc	1%	5-30	Tốt
7	Kháng sinh	4-50mg/l	30-60	khá

Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy.

Việc xử lí thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử lí trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay,lau bằng cồn 70⁰ tới khủy tay, tay áo phải xoắn cao lên, kẹp tóc gọn.. Không nói chuyện hoặc nhảy mũi trong khi đang cấy. Khi cấy không nên chạm tay vào mặt trong của bình cấy cũng như các dụng cụ cấy. Không đưa vào tủ cấy các bình cấy đã bị nhiễm vì bào tử có thể phát tán trong tủ cấy.

2.6. Môi trường

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.

2.6.1. Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
- Các vitamin
- Các amino axít
- Nguồn các- bon: một số các loại đường
- Các chất điều hoà sinh trưởng
- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô...
- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).

2.6.1.1. Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic. Tương tự, Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzym.

Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5.

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật:

- Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P....) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và nhiều chất hữu cơ khác. Canxi và axít boric được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học.

- Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co-factor): Magie, kẽm, sắt... và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzym.

- Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym.

Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng:

- Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật. Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng nitrate và amonium (2-20 mmol/L) là tốt hơn cả. Trong trường hợp chỉ dùng amonium, thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của amonium vượt quá 8 mmol/L trong môi trường được giảm bớt. Khi các ion nitrate và amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mmol/L.

2.6.1.2. Các nguyên tố đa lượng

a. Nguồn carbon (C)

Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp. Khi khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân một phần, thuận lợi hơn cho cây hấp thụ. Trong một số trường hợp, ví dụ nuôi cấy mô cây một lá mầm, đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose. Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật.

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước).

Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơn. Sucrose, trong khi khử trùng môi trường, bị biến đổi thành glucose và fructose. Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau đó là fructose. Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt.

Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể dùng cho nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào được nuôi trên môi trường có chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng thủy phân thông qua các enzyme chẳng hạn như amylase. Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa tinh bột khá nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa sucrose lượng amylase thải ra sẽ giảm ngay.

Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng. Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu, hoặc tương tự sucrose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress nước. Các loại rượu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc.

Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào nuôi cấy. Thí nghiệm với các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric chỉ đạt 15% sinh trưởng so với sucrose.

Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng. Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon. Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh.

Sự thủy phân từng phần sucrose xuất hiện khi môi trường được khử trùng. Các tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưởng trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng autoclave tốt hơn trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng màng lọc (filter). Điều này cho thấy các tế bào thích hợp với nguồn dự trữ có sẵn của glucose và fructose do thủy phân sucrose khi khử trùng bằng autoclave. Sử dụng fructose được khử trùng bằng autoclave không được đề cập đến vì nó có thể gây bất lợi cho sinh trưởng của mô.

b. Nitơ (N):

Thành phần chính của hầu hết các môi trường là nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO₃^-) hoặc amonium (NH₄⁺). Các muối được dùng phổ biến là kali nitrat (KNO₃), nitrat amon (NH₄NO₃) và canxi nitrat (Ca(NO₃)₂.4H₂O). Những hợp chất này cung cấp nitơ vô cơ cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp.

Mô , tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như aminonium và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid. Tỉ lệ amonium và nitrate thay đổi tùy theo loài và trạng thái phát triển của mô.

Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO₃)₂.4H₂O, KNO₃, NaNO₃ hoặc NH₄NO₃. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH₄)₂SO₄ hoặc NH₄NO₃. Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO₃⁺ và NH₄⁺ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu.

Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ. Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng.

Sự biến đổi nitrat: Nitrat không thể sử dụng ngay lập tức để sinh tổng hợp các chất hữu cơ phức tạp mà trước tiên cần phải được khử thành amoniac. Phản ứng diễn ra như sau:

NO₃^-+ 8H⁺+ 8e^-→ NH₃+ 2 H₂O + OH^-

Phản ứng này được thực hiện qua 2 bước nhờ hai enzym: nitrat- và nitrit reductaza. Trước tiên, nitrat được biến đổi thành nitrit nhờ nitrat reductaza. Tiếp theo, nitrit bị khử thành amoniac nhờ enzym nitrit reductaza. Sự biến đổi của nitrat thành nitrit diễn ra trong tế bào chất. Trong hầu hết các cây trồng, sự khử nitrat có thể diễn ra ở cả lá và đỉnh chồi. Sự khử nitrat diễn ra ở mức độ nào phụ thuộc rất lớn vào các nhân tố như: loài, tuổi cây, nồng độ nitrat. Cụ thể, các loài cây thân gỗ có khả năng khử nitrat rất cao. Khi nồng độ nitrat thấp, sự khử hầu như diễn ra ở rễ. Ngược lại, nếu nồng độ nitrat cao thì quá trình này diễn ra cả ở lá. Các cation kết hợp với nitrat có vai trò quan trọng trong việc hấp thu nitrat. Nếu cation là K⁺thì hoạt động của enzym nitrat reductaza ở rễ thấp và nitrat sẽ được vận chuyển lên các đỉnh chồi của cây. Trong trường hợp cation là Ca²⁺thì sự khử ở rễ lại diễn ra mạnh hơn.

Sự khử nitrit thành NH₃nhờ enzym nitrit reductaza diễn ra trong lá cây, trong đó điện tử cần thiết cho phản ứng này được cung cấp từ sự khử các hợp chất sắt trong hệ thống quang hợp.

Sự khử nitơ chứa trong các hợp chất: Amonium và amoniac là những chất độc đối với thực vật ngay ở nồng độ thấp. Do đó chúng cần được chuyển hoá thật nhanh thành các hợp chất phân tử lượng nhỏ có chứa N như: asparagin, arginin, allantoin và betain. Sinh tổng hợp glutamin và glutamat diễn ra cả ở rễ và đỉnh chồi là các quá trình cơ bản trong sự chuyển hoá amonium.

Bên cạnh sự khử độc tính của amonium và amoniac, các hợp chất chứa nitơ phân tử lượng thấp còn có một số chức năng khác. Chức năng quan trọng nhất là cung cấp N trong các liên kết hữu cơ và -NH₂được thực vật hấp thụ như nguồn N hữu cơ cho quá trình sinh tổng hợp các amino axít và protein. Các hợp chất phân tử lượng nhỏ này còn được sử dụng làm chất mang cation như Mn, Cu để vận chuyển các cation qua hệ thống mạch dẫn trong cây. Ngoài ra, chúng còn như một kho dự trữ nitơ dư thừa. Ngược lại với con người và động vật, thực vật không thể bài tiết các hợp chất nitơ hữu cơ như urê nhưng nhờ cơ chế này đã cho phép thực vật dự trữ được nitơ hữu cơ.

c. Phospho (P):

Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật . Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.

Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Ion photphate hóa trị 1 và 2 có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy theo pH. Ion H₂PO₄^- chiếm ưu thế ở pH nhỏ hơn 7, đây là đặc tính của hầu hết môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng là ion dễ được thực vật hấp thụ nhất. Photpho thường được cung cấp dưới dạng photphate hòa tan hạn chế.

Nồng độ photphate hòa tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của mô, có thể do calcium và một số nguyên tố vi lượng bị kết tủa trong môi trường hoặc bị giảm hấp thu vào trong mô. Nồng độ ion photphate cho vào môi trường cao nhất là 18,9 mM, trung bình là 1,7 mM, hầu hết các môi trường chứa photphate khoảng 1.3 mM.

Phospho ở dạng HPO₄^2-được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược lại với nitrat, sunfat, nó không bị khử. Nó có thể có mặt trong thực vật dưới dạng P vô cơ hoặc dạng hợp chất este (R-O-P). Năng lượng thu được khi giải phóng một nguyên tử P khỏi các liên kết (cao năng lượng) là rất quan trọng đối với quá trình trao đổi chất của tế bào.

Axit nucleic : P là một nguyên tố thiết yếu trong cấu tạo của DNA và RNA để nối các đơn phân tử axít ribonucleic để tạo thành đại phân tử.

Phospholipid: Phospholipid của màng sinh học cũng có chứa một lượng lớn P. Trong những phospholipid này, P (qua liên kết este) tạo nên cầu nối giữa diglyxerit với một amin, axit amin hoặc một rượu. Phospholipid có một đầu háo nước, phân tử diglyxerit và một đầu kỵ nước có chứa PO₄^3-. Cả hai đều có chức năng quan trọng trong việc giữ ổn định màng tế bào. Màng tế bào bao gồm hai lớp phospholipid đơn ghép lại tạo thành lớp màng kép lipid. Đầu ưa nước của lớp phospholipid quay ra ngoài hướng về phía các phân tử nước trong khi đuôi kỵ nước lại quay vào phía trong giữa hai lớp của màng tế bào và tương tác lẫn nhau.

Quá trình chuyển hoá năng lượng: Phospho ở dạng liên kết este cao năng (C-P) rất quan trọng đối với quá trình chuyển hoá năng lượng và tổng hợp sinh học ở thực vật. Đóng vai trò quan trọng hơn nữa là các liên kết cao năng giữa hai nguyên tử P như trong phân tử ATP (P-P = 30 kJ). Năng lượng giải phóng trong suốt quá trình thuỷ phân glucoza, quá trình oxi hoá, phosphoryl hoá hoặc quang hợp được sử dụng để tổng hợp ATP. Ngược lại năng lượng này khi cần lại được giải phóng ra qua phản ứng thuỷ phân ATP thành ADP và P vô cơ. Vì vậy ATP được chuyển hoá và tổng hợp mới liên tục. Một gram đỉnh rễ đang trong giai đoạn trao đổi chất mạnh có thể tổng hợp 5g ATP/ ngày với tốc độ tổng hợp trung bình là 30 giây.

Vùng dự trữ P (phosphat): Trong tế bào bao gồm hai vùng dự trữ phosphat khác nhau. Vùng trao đổi, chủ yếu phosphat ở dạng este, nằm trong tế bào chất và ty thể. Vùng không trao đổi, chủ yếu là dạng P vô cơ, nằm trong không bào. Nếu ngừng cung cấp P cho cây, nồng độ P vô cơ trong không bào ngay lập tức sẽ giảm trong khi ở vùng trao đổi tốc độ giảm chậm hơn nhiều. Khi tăng cường cung cấp P, nồng độ P chứa trong các cơ quan của tế bào cũng tăng theo, tuy nhiên khi tăng quá mức bình thường thì chỉ có P vô cơ trong không bào tăng lên. Vì vậy có thể nói, P dư thừa được dự trữ ở không bào dưới dạng P vô cơ.

Các enzym: P vô cơ cũng có khả năng điều chỉnh tốt trong nhiều quá trình trao đổi chất của thực vật. Vậy nên sự phân bố P là cần thiết để điều chỉnh quá trình trao đổi chất của tế bào. Ở cà chua, sự giảm P vô cơ ở không bào trong tế bào chất kích thích hoạt tính của enzym phosphofructokinaza. Enzym này là enzym quan trọng trong sự phân giải cơ chất của phản ứng thuỷ phân glyco và làm tăng sự hô hấp của tế bào trong quá trình chín. Cũng trong thời gian này, sự thiếu hụt P có thể làm chậm quá trình chín của quả.

Trong quá trình tổng hợp tinh bột của lục lạp, P cũng đóng một vai trò quan trọng. Chỉ với nồng độ thấp, P vô cơ đã có thể gây ức chế quá trình tổng hợp tinh bột. Sở dĩ như vậy là do ADP-gluco-pyrophosphorylaza, enzym quan trọng nhất trong quá trình tổng hợp tinh bột, bị kìm hãm bởi P vô cơ và được kích thích nhờ các triossephosphat. Vì thế, sự cân bằng giữa các hợp chất có chứa P là rất quan trọng trong điều hoà tổng hợp tinh bột ở lục lạp. Ngoài ra, P vô cơ cũng tham gia quá trình này theo một con đường khác. Các phân tử vận chuyển phosphat ở màng tế bào sẽ mang P vô cơ vào tế bào và các triosephosphat ra ngoài tế bào, làm nồng độ P vô cơ trong lục lạp tăng, triosephosphat giảm. Điều này lại tác động đến quá trình tổng hợp tinh bột theo cơ chế đã trình bày ở trên. Ribuloza biphosphat (RuBP), với vai trò như một chất nhận CO₂, là hợp chất quan trọng trong sự cố định CO₂. Sự tái tổng hợp này đòi hỏi phải có các triosephosphat. Khi nồng độ P vô cơ cao sẽ kích thích giải phóng các triosephossphat ra khỏi lục lạp, gây thiếu hụt các chất này, do đó làm kìm hãm quá trình cố định CO₂. Ngoài ra, phospho còn quan trọng trong việc điều khiển hoạt động của nhiều enzym khác. Nồng độ phospho tối ưu cho sự sinh trưởng của thực vật là 0,3 – 0,5 g/ kg trọng lượng khô. Sự thiếu P làm cây chậm lớn, lá cây có màu xanh thẫm do trong thời gian bị thiếu P, sự phát triển của lá chậm hơn sự tổng hợp diệp lục tố nên làm tăng nồng độ diệp lục tố trong lá cây.

d. Lưu huỳnh (S):

Lưu huỳnh như SO₄^2-được hấp thụ ở rễ cây với tốc độ chậm. Giống như nitrat, lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym. Lưu huỳnh ở dạng chưa khử được kết hợp trong các sulpholipid và các polysaccharid.

Sự đồng hoá lưu huỳnh: Bước đầu tiên trong quá trình đồng hoá lưu huỳnh là sự hoạt hoá gốc SO₄^2-nhờ enzym ATP sulfurylaza. Phản ứng này tạo ra adenosine phosphosulfate (APS) và P vô cơ. Tiếp theo là hai quá trình hoá học hoàn toàn khác nhau. Một quá trình không diễn ra sự khử lưu huỳnh mà tạo liên kết với các polysaccharide trong sulpholipid. Trong quá trình thứ hai, lưu huỳnh được khử thành nhóm –SH (nhóm thiol) và nhóm sulfuryl của APS được vận chuyển tới gluthantione (Glut-SH). Sau đó nhóm –SH được vận chuyển tới cho acetylserine và phân tách thành acetat và cystein. Cystein là sản phẩm bền đầu tiên trong quá trình đồng hoá và là tiền chất của tất cả các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh trong thực vật, ví dụ như: protein, co-enzym, các hợp chất trao đổi chất thứ cấp... Quá trình đồng hoá lưu huỳnh chủ yếu diễn ra ở lục lạp. Khi thiếu lưu huỳnh, sinh tổng hợp protein bị kìm hãm, lượng diệp lục tố trong lá cây bị giảm sút.

Các protein: Lưu huỳnh có mặt trong các protein có chứa cystein và methionin. Cả hai axít amin này đều là tiền chất của tất cả các hợp chất có chứa lưu huỳnh trong thực vật. Lưu huỳnh, cấu tử hợp thành của nhiều coenzym và các nhóm prosthetic, có chức năng quan trọng trong rất nhiều phản ứng oxy hoá khử, được biểu diễn như sau:

R-SH + HS-R → R-S-S-R.

Gốc R có thể là phần còn lại của phân tử cystein nhưng cũng có thể là tripeptit gluthatione. Gluthatione tan được trong nước và do đó, nó đóng vai trò như một hệ oxi hoá khử ở lục lạp và dịch bào. Cầu lưu huỳnh giữa hai phân tử cystein rất quan trọng trong cấu trúc bậc ba của phân tử protein và hoạt động của enzym. Nhóm –SH, như đã đề cập ở trên có trong thành phần của các coenzym và APS, tạo thành một phần của nhóm chức năng trong phân tử enzym.

Các metallothionein: Các hợp chất phân tử lượng thấp có chứa lưu huỳnh- metallothionein, thường hay được tìm thấy trong thực vật. Hầu hết các chất này đều có chứa cystein. Đặc biệt, các kim loại như: đồng, cadimi và kẽm thường liên kết trong metallothionein. Gần như chắc chắn những phân tử protein nhỏ này tham gia vào sự bài tiết các ion kim loại trên khi chúng dư thừa, trước khi liên kết với nhóm chức năng –SH của các enzym.

Lưu huỳnh chưa bị khử: Lưu huỳnh ở dạng chưa bị khử là thành phần cấu tạo sulpholipid, là phần tử tạo thành cấu trúc của màng sinh học. Lưu huỳnh thường có mặt ở dạng hợp chất este của lưu huỳnh và đường 6 cacbon, ví dụ như glucoza. Sulpholipid có nhiều trên màng thylakoid của lục lạp và tham gia vào quá trình vận chuyển ion qua màng sinh học. Hơn nữa, sự có mặt của sulpholipid trên màng tế bào chắc chắn liên quan đến khả năng chịu muối của thực vật. Mùi vị đặc trưng của một số loài như: hành, tỏi chủ yếu có liên quan đến sự có mặt của các hợp chất có chứa lưu huỳnh dễ biến đổi.

Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 1.2 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6