Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào

tải về 1.2 Mb.

trang	5/6
Chuyển đổi dữ liệu	02.12.2017
Kích	1.2 Mb.
	#34923

1 2 3 4 5 6

2.6.1.3. Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn...)
2.6.1.5. Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô

e. Kali (K):

K⁺là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K⁺ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K⁺ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước.

K⁺ được cung cấp dưới dạng muối KNO₃^,KCl. 6H₂O, KH₂PO₄

Trong thực vật, K⁺là một cation có tính linh động cao, ở cả mức độ tế bào cũng như trong quá trình vận chuyển qua các khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc mạch libe. Trong tất cả các nguyên tố, kali là nguyên tố có mặt với nồng độ cao nhất, ở tế bào chất từ 100 – 200 mM, ở lục lạp từ 20 – 200 mM.

Muối kali có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tính thấm của tế bào. Đối với sự giãn tế bào cũng như các quá trình khác được điều chỉnh nhờ sức trương của tế bào, K⁺có vai trò như một ion trung hoà các ion vô cơ và hữu cơ hoà tan trong dung dịch, đồng thời duy trì pH trong khoảng 7 –8 là pH thích hợp cho hoạt động của hầu hết các enzym.

Vai trò của K⁺đối với các enzym: K⁺cần thiết cho hoạt động của nhiều enzym. Trên 50 enzym của thực vật hoạt động với sự tham gia của K⁺hoặc bị kích thích bởi K⁺. Sự liên kết của K⁺với enzym gây ra sự thay đổi cấu hình không gian của enzym, do đó làm tăng ái lực của enzym với cơ chất. Khi thiếu K⁺người ta thấy có sự tăng nồng độ đường hoà tan và các hợp chất chứa nitơ, kèm theo sự giảm nồng độ tinh bột, chủ yếu do vai trò thiết yếu của kali đối với việc điều khiển hoạt động enzym trong quá trình trao đổi cacbon. Enzym ATPaza màng tế bào cũng chịu sự tác động của K⁺. ở cây trưởng thành, K⁺cần cho quá trình tổng hợp protein. K⁺còn cần thiết trong quá trình dịch mã và tổng hợp tRNA ở ribosome. Sự tổng hợp ribuloza biphosphat cacboxylaza cũng phụ thuộc rất mạnh vào nồng độ K⁺. Đây còn là ion cần thiết cho hoạt động và tổng hợp enzym nitrat reductaza.

Bên cạnh vai trò trong hoạt động của nhiều enzym, K⁺còn điều chỉnh sự cân bằng ion và pH của lục lạp trong quang hợp. K⁺là ion trung hoà quan trọng nhất cho sự đưa dòng H⁺qua màng thylakoid. Ion này cũng có mặt trong sự tạo thành gradien pH màng tế bào cần thiết cho quá trình tổng hợp ATP. Sự tăng nồng độ K⁺dẫn đến sự tăng cường quá trình quang hợp, hô hấp và hoạt động của enzym ribuloza biphosphat cacboxylaza.

Sự giãn của tế bào: Sự tăng kích thước của không bào trung tâm trong tế bào là một quá trình quan trọng trong sự giãn tế bào. Để hình thành không bào, đầu tiên là sự tăng kích thước đủ lớn của thành tế bào, tiếp theo khả năng thẩm thấu của không bào tăng lên. Điều này có thể đạt được nhờ sự tích tụ K⁺gây ra sự tăng mạnh về thể tích của không bào do tính thấm. GA3 và K⁺dường như có tác dụng hỗ trợ nhau trong vai trò làm tăng chiều cao cây.

Sự cân bằng ion: K⁺có vai trò quan trọng cho việc duy trì cân bằng ion. Nó trung hoà các anion kém linh động trong tế bào chất và rất nhiều các anion linh động trong mạch xylem, libe và không bào. Trong quá trình trao đổi nitrat, K⁺có chức năng chủ yếu là vận chuyển ion NO₃^-qua những khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc dự trữ trong không bào. Sau quá trình khử nitrat trong lá cây, lượng K⁺còn lại được sử dụng để tổng hợp các axit hữu cơ trung hoà ion K⁺. Các muối kali của các axit hữu cơ như kali malat được vận chuyển tới rễ, sau đó K⁺có thể nhận ion nitrat ở tế bào rễ và vận chuyển chúng qua mạch xylem.

f. Canxi (Ca):

Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây nhưng cách thức không giống như K⁺ và Mg⁺ vì Ca²⁺ không phải là ion linh động. Calciun có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào . Sự hoạt động của nhiều enzim khác của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca²⁺ vì calcium là đồng yếu tố với những enzim phân giải ATP.

Trong nuôi cấy tế bào, Ca²⁺ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin.

Ca²⁺ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào. Số lượng lớn Ca²⁺gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào.

Ion Ca²⁺tự do có mặt trong tế bào ở nồng độ rất thấp, khoảng 1µM có tác dụng ngăn chặn sự kết tủa P vô cơ. Do hàm lượng ion Ca²⁺trong tế bào thấp nên không có sự cạnh tranh với ion Mg²⁺về vị trí gắn cation và tránh làm bất hoạt enzym. Ion Ca²⁺chỉ có thể di chuyển qua màng tế bào theo một chiều (Ca²⁺chỉ ra ngoài tế bào được nhưng không vào được), do đó đảm bảo được nồng độ ion Ca²⁺nội bào thấp. Đặc biệt trong các tế bào lá, có một lượng lớn canxi liên kết với các không bào. Canxi cần thiết cho sự thiết lập cân bằng ion nhờ trung hoà các anion hữu cơ và vô cơ. Hầu như canxi ở dạng liên kết tạo muối ocxalat. Mặc dù hợp chất này khó tan nhưng nó có vai trò duy trì nồng độ ion Ca²⁺thấp trong lục lạp và tế bào chất. Muối canxiocxalat còn có chức năng điều chỉnh sự thẩm thấu của tế bào. Canxi có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của tế bào và rễ. Ngoài ra sự phát triển của ống phấn cũng phụ thuộc vào canxi, đây là quá trình được định hướng nhờ canxi ngoại bào. IAA tham gia vào quá trình vận chuyển canxi. Chất ức chế auxin như TIBA cũng ức chế sự phân phối Ca²⁺trong thực vật làm xuất hiện sự thiếu hụt canxi.

Vai trò của Ca đối với thành tế bào: Pectin là thành phần quan trọng của màng liên kết giữa các bế bào với nhau và được phân huỷ nhờ enzym polygalacturonase. Tuy nhiên, Ca ức chế mạnh hoạt động của polygalacturonaza. Hoạt động mạnh của enzym này được ghi nhận khi thiếu Ca. Nếu nồng độ Ca có đủ thì hầu hết các pectin sẽ tồn tại dưới dạng muối canxipectat. Nhờ vậy, thành tế bào có khả năng chống chịu tốt đối với hoạt động phá huỷ của enzym polygalacturonaza. Sự có mặt của ion Ca²⁺cũng có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự xâm nhiễm nấm.

Ion Ca²⁺có tác động lớn đến sự ổn định của màng tế bào. Sự thiếu ion Ca²⁺sẽ làm tăng khả năng thoát ra ngoài màng tế bào của các hợp chất phân tử lượng nhỏ. Màng tế bào có thể sẽ bị phân huỷ hoàn toàn khi thiếu hụt nghiêm trọng ion Ca²⁺. Ion Ca²⁺có khả năng làm ổn định màng tế bào thông qua sự tương tác với các nhóm phosphat, cacboxyl của hợp chất phospholipid và protein có mặt trong màng tế bào.

Các enzym: Khác với magie là nguyên tố tham gia vào quá trình hoạt hoá của rất nhiều enzym, canxi chỉ có tác động lên một vài enzym như: amilaza và ATPaza. Ca chủ yếu kích thích các enzym màng tế bào, mà hoạt động của những enzyme này được qui định nhờ cấu trúc màng. Tuy nhiên, ion Ca²⁺cũng có tác dụng kìm hãm một số enzym của tế bào chất. Calmodulin trong tế bào có khả năng hoạt hoá các enzym như phospholipaza bằng cách tạo thành phức của Ca²⁺- calmodulin với enzym. Ngoài ra, người ta còn cho rằng calmodulin có vai trò trong việc vận chuyển ion Ca²⁺tới không bào.

g. Magiê (Mg):

Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồng thời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzim vận chuyển photphate. Ion Mg⁺là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K⁺ vì vậy có vai trò như một cation có thể trung hòa các cation và các acid hữu cơ. Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ không thay đổi nhiều trung bình là 6,8mM. MgSO₄ là nguồn bổ sung ion Mg⁺ duy nhất cho mô cấy.

Mg²⁺là một ion rất linh động có khả năng hình thành phức với các nhóm chức năng khác nhau.

Vai trò Mg²⁺của đối với quang hợp: Mg²⁺là nguyên tử trung tâm trong phân tử chlorophyl của hệ quang hợp I và II. Trong phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dòng điện tử, từ đó tạo ra ATP và NADPH đóng vai trò quan trọng đối với cố định CO₂. Nếu Mg²⁺có mặt với nồng độ tối ưu thì khoảng 10 - 20% ion Mg²⁺trong lá được cố định ở lục lạp. Nồng độ cao các ion Mg²⁺và K⁺là cần thiết để duy trì pH khoảng 6,5 – 7,5 trong lục lạp và tế bào chất, trái với ở không bào pH chỉ vào khoảng 5- 6. Trong một chừng mực nào đó, pH xác định cấu trúc của protein và enzym nên nó ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein và chức năng của lục lạp.

Vai trò Mg²⁺đối với hoạt tính của các enzym: Mg²⁺là ion cần thiết cho cấu trúc bậc ba của nhiều phức enzym-cơ chất vì nó tạo ra dạng cấu trúc không gian phù hợp giữa enzym và cơ chất. Mg²⁺tham gia vào quá trình tổng hợp protein với nhiều cấp độ khác nhau. Mg²⁺tạo thành cầu nối giữa các dưới đơn vị của ribosome. Khi thiếu Mg²⁺, các dưới đơn vị sẽ bị tách ra và quá trình tổng hợp protein bị ngừng lại. Sự hoạt động của các enzym như: RNA polymeraza tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RNA đòi hỏi phải có mặt Mg²⁺, do đó thiếu Mg²⁺sẽ kìm hãm sinh tổng hợp RNA. ở lá cây, 25% protein tổng số nằm trong lục lạp, nếu thiếu Mg²⁺thì ngay lập tức cấu trúc và chức năng của lục lạp bị ảnh hưởng.

Mg²⁺còn quan trọng trong hoạt động của enzym ribulose biphosphat cacboxylaza. Đây là một enzym phụ thuộc nhiều vào pH và Mg²⁺. Liên kết của Mg²⁺với enzym làm tăng ái lực với cơ chất CO₂và Vmax.

Vai trò Mg²⁺đối với chuyển hoá năng lượng: Mg là một chất không thể thiếu trong quá trình chuyển hoá năng lượng của thực vật do vai trò quan trọng của nó đối với sinh tổng hợp ATP (ADP + P vô cơ = ATP), đặc biệt là ở lục lạp. Trong quá trình này, Mg²⁺tạo thành cầu nối giữa enzym và ADP. Ngoài ra, Mg²⁺còn có khả năng tạo phức với ATP. Enzym ATPaza vận chuyển các nhóm phosphoryl cao năng, cung cấp cho protein hoặc đường. Mặc dù Mg²⁺có nhiều chức năng như vậy nhưng hầu như nó lại tồn tại ở dạng dự trữ trong không bào. Tại đây, nó đóng vai trò như một ion trung hoà với các anion hữu cơ và vô cơ trong việc cân bằng ion.

2.6.1.3. Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn...)

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng. Đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo). Fe dường như thích hợp hơn khi được cung cấp dưới dạng chelate Fe, và Zn được dùng bình thường trong các môi trường nuôi cấy. Các dạng muối tatrate và citrate Fe khó hòa tan và thường hay kết tủa trong môi trường. Vấn đề này có thể khắc phục bằng cách dùng diaminetetraacetic acid (EDTA)-chelate Fe thay cho citrate Fe, đặc biệt đối với quá trình tạo phôi. Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng.

Một số môi trường nuôi cấy được làm giàu bằng cobalt (Co), iodine (I) và sodium (Na), nhưng các yêu cầu nghiêm ngặt về các nguyên tố này cho sinh trưởng của tế bào đã không được thiết lập. Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với Cu và Co là 0,1 µmol/L, Fe và Mo là 1 µmol/L, I là 5 µmol/L, Zn là 5-30 µmol/L, Mn là 20-90 µmol/L và B là 2-5100 µmol/L được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm.

Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu cầu của thực vật đối với các chất này. Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0.5 mM. Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi trường ở nồng độ < 0.5 mM.

Nhu cầu của cây đối với nguyên tố vi lượng là rất thấp. Do vậy những nguyên tố này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng. Hầu hết các nguyên tố vi lượng sử dụng ở lượng nmol. Một số nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các thành phần của môi trường như agar, các chất bổ sung như nước dừa, dịch chiết nấm men (yeast extract), các muối và nước. Tầm quan trọng của một số nguyên tố vi lượng trong thành phần môi trường còn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Co, Al, Ni... có thể có lợi đối với thực vật nhưng cũng có thể là không cần thiết. Trong thực tế, hầu hết các nguyên tố vi lượng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là quan trọng, còn vai trò các anion có thể là không cần thiết. Ion SO₄^2-dư thừa trong môi trường và chủ yếu phát sinh từ các muối MgSO₄, K₂SO₄

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn. Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao nhất trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nhìn chung cả phần anion và cation của các nguyên tố đa lượng đều quan trọng đối với tế bào thực vật. Ví dụ như KNO₃, cả K⁺và NO₃^-là cần thiết. Trong nhóm các nguyên tố đa lượng, các muối có chứa nitơ chủ yếu ở dạng kali nitrat, amonium hoặc calxi nitrat.

a. Sắt (Fe):

Trong cây, sắt chủ yếu được gắn với các phức chất. Hàm lượng Fe²⁺, Fe³⁺tự do rất thấp (10^-10mM). Hầu hết thực vật chỉ hấp thu Fe²⁺. Do đó, Fe³⁺cần được khử thành Fe²⁺ở bề mặt rễ trước khi nó được chuyển vào trong tế bào chất (chỉ một số loại cỏ là hấp thu sắt chủ yếu dưới dạng Fe³⁺).

Trong khi vận chuyển đi xa, qua mạch xylem của cây, sắt chủ yếu được di chuyển dưới dạng hợp chất sắt-cacbonhydrate (ở dạng Fe³⁺-citrate hay dạng phức hợp sắt-peptide). Chức năng chính của sắt trong thực vật là tạo các liên kết sắt. Các chức năng cơ bản như một hệ thống oxi hoá khử thuận nghịch được biểu diễn trong phản ứng dưới đây:

Fe(II) <---> Fe(III) + e^-

Các hemoprotein (các protein chứa sắt: Các hemoprotein được biết đến nhiều nhất là các cytochrome, có chứa một phức hệ sắt-porphyrin. Các cytocrome tạo thành một phần hệ thống oxi hoá trong chuỗi truyền điện tử ở lục lạp và ty thể của tế bào thực vật.

Chức năng của các cytocrome như chất trung gian cho điện tử, cần cho quá trình khử nitrat thành nitrit nhờ enzym nitrat reductase trong quá trình đồng hoá nitơ. Trong quá trình cố định nitơ ở cây họ đậu, các cytocrome là trung gian trong chuỗi truyền điện tử qua đó các điện tử được truyền đi để cuối cùng khử N₂thành NH₃.

Các catalase và peroxidase tham gia vào quá trình quang hô hấp, thuỷ phân đường và khử độc của hydrrogen peroxid, theo cân bằng sau:

2H₂O₂---> catalase ---> 2H₂O + O₂

Hydrogen peroxit được tạo ra trong quá trình khử superoxit nhằm trung hoà các gốc superoxit. Hydrogen peroxit, đến lượt nó lại được trung hoà nhờ enzym catalase.

Các peroxidase có rất nhiều trong tế bào thực vật. Thành tế bào gắn peroxidase xúc tác cho quá trình trùng hợp của phenol với lignin. Rễ chứa lượng lớn peroxit và có vai trò hấp thu sắt của cây. Lượng phenol dư thừa khi thiếu sắt sẽ được tiết ra ngoài.

Các protein sắt-lưu huỳnh: Nhóm protein chứa sắt thứ hai là các protein sắt- lưu huỳnh. Sắt được gắn trong nhóm thiol (-SH) của cystein và lưu huỳnh vô cơ. Ferridoxin là protein chứa sắt lưu huỳnh phổ biến nhất và là chất mang trong các phản ứng truyền điện tử được xúc tác bởi nitrit reductaza, sulphat reductaza, quá trình tổng hợp NADP⁺trong quang hợp và khử nitơ được thực hiện nhờ phức hệ nitrogenaza. Ba loại protein sắt lưu huỳnh khác nhau, hoạt động liên tiếp nhau, đều nằm trong chuỗi truyền điện tử của phức hệ nitrogenaza.

Bên cạnh hai nhóm này, thực vật còn có những enzym khác có chứa sắt. Nguyên tố này cần cho các phản ứng oxi hoá khử và sự định vị của các phức hợp enzym - cơ chất.

Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: Trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. Khi thiếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá.

Trong lá non, thiếu sắt sẽ dẫn đến sự giảm nhanh nồng độ chlorophyl do quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại. Số lượng ribosom cũng giảm mạnh.

Thiếu sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái. Sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng lông rễ tăng.

b. Bo (B):

Vai trò của nguyên tố B trong sinh hóa học và sinh lí học thực vật chưa được biết nhiều. B cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng bởi vì nó có mặt trong sự sinh tổng hợpcác base nitơ đặc biệt là uracil, cũng như cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và acid phenolic.

Người ta có thể sử dụng nhiều nồng độ B khác nhau trong môi trường nuôi cấy từ 50-100 m. Thiếu B sẽ làm giảm sự sinh tổng hợp cytokinin. Sự phân chia tế bào bị kìm hãm do có sự giảm sinh tổng hợp ARN trong nhân.

Bo được hấp thu bởi rễ và được chuyển tới các bộ phận của cây nhờ các xylem. ở các màng tế bào, Bo có mặt chủ yếu ở dạng liên kết este. Không có bất cứ một enzym đã biết nào có chứa hoặc được hoạt hoá bởi Bo.

Có những chỉ dẫn cho biết Bo có mặt ở trên hoặc bên trong các màng, có thể ảnh hưởng tới hoạt động của các enzym liên kết màng. Các chức năng chủ yếu của Bo là ở ngoại bào, được phát sinh trong quá trình hoá gỗ của thành tế bào và sự phân hoá xylem.

Thành tế bào: Những liên kết este đường- Bo là một phần cấu trúc của các hemicellulose trong thành tế bào. Hầu hết Bo trong thực vật tồn tại ở dạng este trong thành tế bào của cây. Yêu cầu về Bo đối với cây hai lá mầm cao hơn so với cây một lá mầm. Có thể giả định rằng B, cũng giống như calci, có chức năng điều hoà quá trình tổng hợp thành tế bào cũng như ổn định các thành phần của thành và màng tế bào.

Sự thiếu hụt Bo ngay lập tức ức chế quá trình phát triển chiều dài của các rễ sơ cấp và thứ cấp. Hơn thế, Bo góp phần điều hoà quá trình trao đổi phenol và tổng hợp lignin.

c. Đồng (Cu):

Đồng hiện diện trong hệ thống enzim cytochrome oxidase của chuổi vận chuyển điện tử hô hấp. Trong thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hóa trị 1 và 2. Nồng độ đồng cao sẽ gây độc cho mô. Hầu hết các môi trường nuôi cấy có Cu²⁺ với hàm lượng 0,1-10 m. Các ion đồng được bổ sung vào dưới dạng sulfate đồng, đôi khi người ta cũng có thể bổ sung đồng dưới dạng CuCl ₂hoặc CuNO_3.

Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO₄^2-, thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 m.

Đồng là một cation hoá trị 2 và được hấp thu vào cây dưới dạng Cu²⁺hay dưới dạng phức chất của nó. Nếu nồng độ Cu²⁺và phức đồng tương đương nhau, cây dường như ưa ion đồng tự do hơn.

Trong xylem và phloem, đồng hầu như tồn tại dưới dạng phức, và chủ yếu là dạng một phức amino axit- đồng. Trong tế bào, đồng chủ yếu là thành phần của phức hệ enzym và rất quan trọng trong các phản ứng oxi hoá khử [(Cu²⁺)/(Cu⁺)] được thực hiện nhờ những enzym này. Thiếu đồng lập tức dẫn đến sự giảm hoạt độ của các enzym chứa đồng.

Vai trò của đồng đối với quang hợp: Khoảng 50% đồng trong lục lạp được gắn với plastocyanin, ở giữa chuỗi truyền điện tử, giữa quang hệ I và quang hệ II, có chứa 1 nguyên tử đồng trên 1 phân tử. Trong trường hợp thiếu đồng, nồng độ các plastocyanin sẽ bị giảm. Cũng giống như plastocyanin, các plastoquinone đóng vai trò quan trọng trong truyền điện tử giữa quang hệ I và quang hệ II. Khi đồng bị thiếu, màng lục lạp sẽ thiếu 2 protein điều hoà chuyển động của các plastoquinone. Để tổng hợp các plastoquinone cần phải có enzym laccase, đây là một enzym chứa đồng và hoạt động của nó sẽ bị giảm ngay khi thiếu đồng. Do đó, hiện tượng thiếu đồng nhanh chóng kéo theo hiện tượng giảm quang hợp.

Enzym super oxide dismutase: Cu cùng kẽm là một phần của enzym super oxide dismutaza (Cu-Zn.SOD), đóng vai trò quan trọng trong quá trình trung hoà gốc anion superoxide O₂^-hoạt tính mạnh được tạo thành trong quá trình quang hô hấp. Bên cạnh Cu-Zn.SOD, một SOD chứa mangan cũng có trong tế bào.

SOD hoá giải độc của gốc O₂^-hoạt động thành H₂O₂và O₂, nhờ đó bảo vệ tế bào trước khả năng phá huỷ của gốc này. SOD cùng với catalase phản ứng như sau:

O₂+ e^----> O₂^-(superoxide)

O₂^-+ O₂^-+ 2H⁺---> SOD ---> H₂O₂

2H₂O₂---> catalase ---> 2H₂O + O₂

Superoxide được giải độc nhờ SOD và ngay sau đó giải phóng H₂O₂thành oxi và nước nhờ catalase.

Các enzym SOD chứa đồng - kẽm chủ yếu được tìm thấy ở chất nền stroma của lục lạp. Trong lá non, 90% SOD tập trung ở lục lạp và chỉ có 4-5 % ở ti thể. Thiếu đồng sẽ xảy ra những thay đổi trong cấu trúc lục lạp, điều này thể hiện rõ chức năng bảo vệ của đồng.

Đồng cũng đóng vai trò quan trọng trong chuỗi truyền điện tử của ti thể như cytochrome oxidase có chứa 2 nguyên tử đồng và 2 nguyên tử sắt.

d. Mangan (Mn):

Manganese là một trong những nguyên tố vi lượng quan trọng nhất, gần như luôn có mặt trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ của Mn trong môi trường tương đương với Fe và B. Mn có tác động hóa học tương tự như Mg+ nên có thể thay thế cho Mg+ trong một số hệ thống enzim.

Mangan tồn tại trong thực vật ở dạng ion Mn²⁺không liên kết, hoá trị hai và ở dạng này nó được chuyển từ rễ qua mạch xylem đến các phần khác của cây.

Nguyên tố này liên kết chặt với một số loại protein chứa kim loại (metalloprotein), hoặc như một thành phần cấu trúc của enzym hoặc như một phần trong hệ oxi hoá khử [Mn(II)/Mn(III)].

Phản ứng Hill: Mangan có hai chức năng quan trọng trong thực vật. Ion này liên quan đến phản ứng ban đầu được gọi là phản ứng Hill của quang hệ II, trong đó nước được phân ly thành oxy và các photon, theo phương trình sau:

2H₂O ---> O₂+ 4H⁺+ 4e^-

Có giả thiết cho rằng 4 phân tử mangan là thành phần của một protein, xúc tác cho quá trình quang phân ly nước. Các electron được giải phóng ra tiếp tục chuyển tới magie chứa trong phức hệ 680, trung tâm của quang hệ II.

Enzym super oxide dismutase: Cho đến nay mới chỉ có một vài loại enzym chứa mangan được phân lập. Enzym có chứa mangan quan trọng nhất là Mn-SOD. (Xem phần về đồng để biết thêm thông tin về SOD). Cũng giống như đồng, nếu thiếu mangan, sẽ xẩy ra các thay đổi trong cấu trúc của lục lạp, thể hiện rõ nhất ở hệ thống bảo vệ của mangan.

e. Coban (Co):

Cobalt có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật . nồng độ sử dụng là 1 m, đôi khi người ta có thể sử dụng nồng độ Cobalt cao gấp 10 lần. Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12 có liên quan đến sự sinh tổng hợp acid nuclêic nhưng chưa có bằng chứng nào về tác động của nó lên sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trường nuôi cấy.

Một trong những mục đích của việc bổ sung cobalt vào môi trường nuôi cấy có lẽ là chống lại sự gây độc của các chelat kim loại và có thể ngăn cản các phản ứng oxi hóa gây ra bởi đồng và sắt.

Coban đóng vai trò quan trọng trong quá trình cố định nitơ ở rễ cây họ đậu. Coban là thành phần cần thiết của enzym cobalamin. Co (III) là thành phần kim loại định vị giữa 4 nguyên tử nitơ trong cấu trúc porphyrin. Ba hệ thống enzym của vi khuẩn Rhizobium được biết tới có chứa Co. Người ta thấy rằng có mối liên hệ giữa nồng độ Co với sự cố định nitrogen và sự phát triển rễ củ. Co có vai trò trong quá trình tổng hợp methyonine ở vi khuẩn, tổng hợp ribonucleotide và enzym methymalonyl-coenzyme A mutaza, một enzym cần thiết cho sự tổng hợp leghemoglobin.

Không ai biết chắc rằng liệu Co có giữ vai trò gì ở thực vật bậc cao hay không. Chỉ có một enzym phụ thuộc cobalamin đã được biết tới là leucine-2,3-aminomutase ở khoai tây. Đối với thực vật bậc thấp, Co là yếu tố cần thiết và có mặt trong một số cấu trúc dưới tế bào và thylakoid ở lục lạp.

f. Molybden (Mo):

Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO₄^2- . Molydate thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 m.

Molybden chủ yếu tồn tại ở dạng MoO₄^2-, một dung dịch giống như nước. Trong môi trường axít yếu, ion molybden tuỳ thuộc vào độ axít có thể nhận 1 hoặc 2 proton theo phương trình sau:

MoO₄^2----> HMoO₄^---->H₂MoO₄

Molybden có khả năng chuyển vận qua mạch xylem và phloem như ion MoO₄^2-.

Nitrogenase: Một số enzym sử dụng Mo như một co-factor. Hai loại enzym có molybden được mô tả nhiều nhất là nitrogenase và nitrate reductase. Nitrogenase liên quan đến quá trình cố định nitơ trong nốt sần ở rễ cây họ đậu nhờ vi khuẩn Rhizobium:

N₂+ 8H⁺+ 8e^----> 2NH₃+ H₂

Molybden liên quan trực tiếp đến quá trình khử N₂. Phân tử nitơ được gắn với nguyên tử molybden trong phức hệ nitrogenase. Mỗi phân tử nitơ gắn với hai nguyên tử molybden mà chính chúng lại là một phần của phân tử protein sắt-molybden. Sau quá trình hoạt hoá phức hệ enzym nitrogenase sử dụng ATP, phức hệ sắt-molybden thay đổi cấu trúc của nó. Dựa trên sự thay đổi hợp lý này, quá trình khử N₂xẩy ra.

Nitrate reductase: Nitrate reductase khử nitrat thành nitrit trong quá trình đồng hoá nitơ ở tế bào thực vật. Nitrate reductase chứa 1 phân tử heme-sắt và 2 nguyên tử molybden. Enzym này xúc tác cho quá trình khử nitrat thành nitrit. Sự hoạt động của nitrat reductase bị giảm mạnh khi thiếu molybden nhưng có thể khôi phục nhanh chóng ngay khi thêm molybden vào môi trường.

g. Kẽm (Zn):

Thiếu kẽm thì sự sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và diệp lục tố sẽ bị giảm đi. Thực vật có đốt thân ngắn, lá nhỏ, đồng thời tế bào trần cũng kém phát triển.

Trong thực vật có mối quan hệ gần gũi giữa Zn và nồng độ auxin nội sinh. Người ta cho rằng , kẽm là một thành phần trong enzim có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA là trytophan. Nồng độ của kẽm bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 0,1-70 m, như vậy sự dư kẽm trong môi trường nuôi cấy ít gây độc cho mô.

Kẽm được hệ rễ hấp thu dưới dạng Zn²⁺. Trong mạch xylem nó được chuyển vận dưới dạng ion Zn²⁺hoặc muối kẽm của một axit hữu cơ. Nguyên tố này là một hợp phần kim loại của một số enzym. Nó có thể là một cofactor cấu trúc cũng như cofactor điều hoà của phức hệ enzym.

Các enzym: Thực vật có một số loại enzym chứa kẽm, bao gồm cả enzym dehydrogen hoá rượu trong vùng mô phân sinh của cây.

Trong phức hệ enzym SOD, Zn liên kết với Cu thay cho nguyên tử nitơ từ histidine (xem thêm về SOD trong phần đồng).

Enzym cacbon anhydraza cố định CO₂, theo cân bằng sau:

CO₂+ H₂O <---> HCO₃^-+ H⁺

Phản ứng này giúp thực vật có thể dự trữ CO₂dưới dạng HCO₃^-một cách thuận nghịch. Sau khi chuyển thành CO₂, HCO₃^-có thể sử dụng làm cơ chất cho enzym ribulose biphosphate carboxylase. Enzym này có 6 tiểu phần dưới đơn vị, mỗi tiểu phần có 1 nguyên tử kẽm gắn vào và có thể tìm thấy trong lục lạp và tế bào chất.

Tổng hợp protein: Kẽm rất quan trọng trong quá trình tổng hợp protein. Thiếu kẽm gây ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protein. Sự tập trung ribosom và sự tích luỹ các tiền chất của protein như các amino axít và các amin, có thể xẩy ra nhờ kẽm. Zn cần cho hoạt động của RNA polymeraza. Dưới điều kiện thông thường, RNA polymeraza chứa 2 nguyên tử Zn, tạo ra cấu trúc điển hình của enzym. Hơn nữa, có 1 mối quan hệ nghịch tương ứng giữa nồng độ Zn và hoạt động của RNAse . Nồng độ Zn thấp sẽ làm tăng hoạt động của RNAse.

Tổng hợp IAA: Thiếu kẽm cũng phá hỏng quá trình tổng hợp indol acetic acid trong cây (Indol ---> Trytophan ---> Indol Acetic Acid)

Kẽm đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp tryptophan, một tiền chất của IAA. Ví dụ, thiếu kẽm trong ngô có thể thay thế bằng cách bổ sung tryptophan.

h. Chlor (Cl):

Ion Cl^- cần thiết cho sự tăng trưởng của thực vật nhưng nó ít có mặt trong các phản ứng sinh học và có vai trò với một lượng rất nhỏ. Thông thường trong môi trường nuôi cấy mô, nồng độ Cl^- cần thiết là 3mM trung bình là 6mM. Một số loài thực vật nhạy cảm với Cl^-.

Chlo có ở thực vật dao động từ 70 đến 700 mM trong 1 kg trọng lượng khô (2000 đến 20000 mg/kg trọng lượng khô). Chlo được hấp thu dưới dạng Cl^-và rất cơ động trong cây. Chức năng chính của ion này là điều hoà thẩm thấu và bổ sung các chất mang.

Trong lục lạp có chứa hàm lượng chlo lớn. Người ta cho rằng chlo đóng vai trò hết sức quan trọng trong quang hợp.

Các lục lạp của rau chân vịt và củ cải đường chứa chlo ở nồng độ xấp xỉ 100mM nhưng trong lá, chỉ có dưới 10mM , cho thấy ưu thế rõ ràng của chlo tập hợp trong lục lạp.

Năng lực thẩm thấu: Ion Cl^-điều hoà sự đóng, mở khí khổng. Tình trạng thiếu chlo làm khí khổng mở mãi, có thể gây tình trạng mất nước nghiêm trọng.

Chlo rất quan trọng trong điều hoà năng lực thẩm thấu của các không bào và với các quá trình liên quan đến sức trương.

Sự trao đổi nitơ: Chlo hoạt hoá enzym tổng hợp asparagin, một enzym quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ. Enzym này chuyển hoá glutamin thành asparagin và axit glutamic. Trong điều kiện có Cl^-, tốc độ của phản ứng tăng lên gấp 7 lần. Bởi thế, chlo đã thực hiện một chức năng quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ ở các loài thực vật sử dụng asparagin như chất mang.

2.6.1. 4.Các vitamin

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá.

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vtrro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1-10 mg/l. Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật. Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1-5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l. Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó cũng được chứng minh kích thích cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật. Người ta cho rằng myo-inositol được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào. Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l.

Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy. Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp.

Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic axít, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS. Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô.

Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp. Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic axit (vitamin B₃), canxi pantothenate (vitamin B₅) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy.

ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm trí còn có hại (gây độc).

a. Vitamin B1 (Thiamine.HCl, Aneurin)

Là một chất bổ sung rất cần cho môi trường nuôi cấy. Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vit B1. Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc chẳng hạn.

b. Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin)

Có thể khử trùng bằng nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ. Đối với nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối với nuôi cấy trong tối có thể tăng lên 10-50 ppm.

c. Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin)

Là tiền chất của pyridoxal-phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau:

Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate

d. Myo-Inositol (Bios I)

Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine. Inosit là chất bền vững khi khử trùng. Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm. Khi phân tích thành phần của nước dừa người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung tính.

e. Biotin (Bios II)

Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô. Chỉ sử dụng ở nồng độ rất thấp từ 0,001-0,01 ppm.

f. Acid pantothenic (Bios III, Vit B5)

Được sử dụng để làm thành phần của coenzyme A .

g. Nicotinic acid và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưởng của tế bào ở nhiều loài. Các vitamin khác như folic acid, ascorbic acid, vitamin E (tocophenol), và ρ-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào, đặc biệt khi tế bào sinh trưởng ở mật độ quần thể rất thấp. Nói chung, các vitamin này được bổ sung trong khoảng 0,1-10,0 ppm.

2.6.1.5. Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô

a. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sang cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.

Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adenine. Casein hydrolysate nói chung được sử dụng với nồng độ 0,05-0,1%. Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Một ví dụ về amino acid trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự tăng trưởng của tế bào là glysine 2 mg/l, glutamine đến 8 mM, asparagine 100 mg/l, L-arginine và cysteine 10 mg/l và L-tyrosine 100 mg/l. Tyrosine cũng được sử dụng để kích thích sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy tế bào nhưng chỉ nên sử dụng trong môi trường có agar. Cung cấp adenine sulfate vào môi trường nuôi cấy có thể kích sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy và kích thích mạnh sự tạo chồi.

Các mô được nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết cho các quá trình trao đổi chất khác nhau. Mặc dù thế, việc bổ sung các amino acid vào môi trường vẫn cần thiết để kích thích sinh trưởng tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế bào. Không giống như các N vô cơ, các amino acid được các tế bào thực vật hấp thụ nhanh hơn. Casein hydrolysate (0,05-0,1%), L-glutamine (8 mmol/L), L-asparagine (100 mmol/L), L-glycine (2 mmol/L), L-arginine và L-cystein (10 mmol/L) là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy. Tyrosine (100 mmol/L) chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường. Các amino acid được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của tế bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn. Bổ sung vào môi trường adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng tạo chồi.

Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 1.2 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6