Chương những khái niệm cơ BẢn học thuyết tế bào

tải về 1.2 Mb.

trang	6/6
Chuyển đổi dữ liệu	02.12.2017
Kích	1.2 Mb.
	#34923

1 2 3 4 5 6

b. Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi. Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đên môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v).

Bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, cà rốt, dây thường xuân và cà chua. Ngược lại, nó gây ức chế ở thuốc lá, đậu tương và các loài thuộc chi Camellia. Nói chung AC được rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở nồng độ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy. AC cũng giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì.

c. Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941,1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn.

Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v).

d. Bột chuối

Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy mô một số cây trồng như phong lan. Hàm lượng sử dụng vào khoảng 40g bột khô/l. Để tránh đóng cục, cần bổ sung bột vào dung dịch một cách từ từ rồi khuấy đều. Nước chiết từ khoảng 100 g thịt quả chuối xanh cũng được sử dụng bổ sung vào môi trường.

e. Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp khác

Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nấm men (yeast extract), casein thuỷ phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.

f. Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)

Với dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành phần hóa học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng.

g. Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH)

Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid.

h. Hỗn hợp amino acid nhân tạo

Dựa vào những kết quả phân tích các hỗn hợp chất tự nhiên nói trên nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp amino acid nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng. Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau, có thể do yêu cầu amino acid của từng loại tế bào là không giống nhau. Trong môi trường lỏng để nuôi callus lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng.

i. Agar

Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu ôxy. Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại bằng agar; một loại tinh bột được chế từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1%.

2.6.1.6. Các chất điều hoà sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

a. Nhóm các auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng. Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba). Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn. Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng.

Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn chưa được biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã cung cấp những kết quả mới thú vị. Trong những năm qua, một số gen mã hóa cho các protein liên kết auxin (auxin binding proteins) đã được tạo dòng (cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mới về gen cảm ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu được. Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H⁺ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương. Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ.

Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,…

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào.. Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn. Nói chung các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng (Razdan 1994)

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyaxetic axid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic axid). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus. Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng.

Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào
- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh.
- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem).
- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô.

- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)
- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)
- Tạo phôi soma (2,4-D)

b. Nhóm các cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6---dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng.

Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea. Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm.

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA). Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định.

- Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa.

Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác, Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: ngô).

- Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin. Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là:

- 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao. BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất.

Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào
- Tạo và nhân callus
- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô
- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh
- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào
- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)
- Ức chế sự hình thành rễ
- Ức chế sự kéo dài chồi
- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

c. Gibberellin

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA₃.

Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật.

Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó.

Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính. So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng. GA3 có tính hoà tan trong nước.

Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit.
- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin.
- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch.
- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa
- Ức chế sự hình thành rễ bất định
- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây
- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)
- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn
- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt
- Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi

e. Abscisic axít (ABA)

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng. ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định

Trong nuôi cấy mô và tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vât. Các tác dụng cơ bản của ABA là:

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả
- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng
- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt
- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành
- Gây ra sự đóng khí khổng

f. Ethylene

Các chức năng cơ bản của ethylene:
- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Làm chín quả

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh
- Điều khiển sự chín của một số loại quả
- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá

Bảng 2.3. Các chất thuộc nhóm Auxin

Tên các chất

Phân tử lượng và tương đương

Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng

Phân tử lượng

Số M = 1mg/L

Dung môi

Pha loãng

Bảo quản khô

Bảo quản lỏng

Khử trùng

Nồng độ sử dụng (mg/L)

p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA)

186.6

5.36

EtOH

—

2-8⁰C

0.1-10.0

2,4-Dichlorophenoxy-

acetic acid

221

4.53

—

2-8⁰C

0.01-6.0

2,4-Dichlorophenoxy-

acetic acid Sodium salt

243

4.12

Nước

—

2-8⁰C

0.01-6.0

Indole-3-acetic acid Free acid (IAA)

175.2

5.71

EtOH/1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.01-3.0

Indole-3-acetic acid Sodium salt

197.2

5.07

Nước

2-8⁰C

-0⁰C

CA/F

0.01-3.0

Indole-3-acetic acid methyl ester

189.2

5.29

—

2-8⁰C

—

Indole-3-acetyl-L-aspartic acid

290.3

3.45

0.5N NaOH

Nước

-0⁰C

0.01-5.0

Indole-3-butyric acid (IBA)

203.2

4.90

EtOH/1N NaOH

Nước

2-8⁰C

-0⁰C

CA/F

0.1-10.0

Indole-3-butyric acid Potassium salt (K-IBA)

241.3

4.14

Nước

—

2-8⁰C

-0⁰C

CA/F

0.1-10.0

Alpha-Naphthalene-

acetic acid Free acid (NAA)

186.2

5.37

1N NaOH

Nước

2-8⁰C

0.1-10.0

Beta-Naphthoxy-

acetic acid Free acid (NOA)

202.2

4.95

1N NaOH

Nước

2-8⁰C

0.1-10.0

Phenylacetic acid (PAA)

136.2

7.34

EtOH

—

2-8⁰C

CA/F

0.1-50.0

Picloram

241.5

4.14

DMSO

—

2-8⁰C

0.01-10.0

2,4,5-Trichlorophenoxy

acetic acid (2,4,5-T)

255.5

3.91

EtOH

—

2-8⁰C

0.01-5.0

2,3,5-Triiodobenzoic acid Free acid (TIBA)

499.8

2.00

1N NaOH

Nước

-0⁰C

0.05-5.0

Ký hiệu: CA = coautoclavable (Khử trùng cùng với các chất khác trong môi trường)

F = filter sterlize: Khử trùng bằng lọc qua phin lọc

CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác của môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung thêm hoặc khử trùng bằng lọc qua phin lọc.

Bảng 2.4. Các chất thuộc nhóm cytokinin

Tên hóa chất

Phân tử lượng và tương đương

Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng

Phân tử lượng

Số M = 1mg/L

Dung môi

Pha loãng

Bảo quản

Bảo quản lỏng

Khử trùng

Nồng độ sử dụng (mg/L)

Adenine Free base

135.1

7.40

1.0 HCl

Nước

2-8⁰C

50-250

Adenine hemisulfate Hemisulfate salt

184.2

5.43

Nước

—

2-8⁰C

50-250

6-Benzylaminopurine (BA)

225.3

4.44

1N NaOH

Nước

2-8⁰C

CA/F

0.1-5.0

6-Benzylaminopurine Hydrochloride

261.7

3.82

Nước

—

2-8⁰C

CA/F

0.1-5.0

6-Benzylaminopurine (BA hoặc BAP)

225.3

4.44

1N NaOH

Nước

2-8⁰C

CA/F

0.1-5.0

N-Benzyl-9-(2-tetrahydropyranyl)adenine (BPA)

309.4

3.23

EtOH

—

-0⁰C

CA/F

0.1-5.0

N-(2-Chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea (4-CPPU)

247.7

4.04

DMSO

—

2-8⁰C

0.001-1.0

6-(gamma,gamma-Dimethylallylamino)

purine (2iP)

203.2

4.92

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

1.0-30.0

6-(γ, γ-Dimethylallylamino) purine (2iP)

203.2

4.92

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

1.0-30.0

1,3-Diphenylurea (DPU)

212.3

4.71

DMSO

—

2-8⁰C

0.1-1.0

Kinetin

215.2

4.65

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.1-5.0

Kinetin

215.2

4.65

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.1-5.0

Kinetin

215.2

4.65

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.1-5.0

Kinetin Hydrochloride

251.7

3.97

Nước

—

-0⁰C

CA/F

0.1-5.0

1-Phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea

220.2

4.54

DMSO

—

2-8⁰C

CA/F

0.001-0.05

Trans-Zeatin Free base

219.2

4.56

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.01-5.0

Zeatin

219.2

4.56

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.01-5.0

Trans-Zeatin Hydrochloride

255.7

3.91

Nước

—

-0⁰C

CA/F

0.01-5.0

Trans-Zeatin riboside

351.4

2.85

1N NaOH

Nước

-0⁰C

0.01-5.0

Ký hiệu: CA = coautoclavable (Khử trùng cùng với các chất khác trong môi trường)

F = filter sterlize: Khử trùng bằng lọc qua phin lọc .

CA/F : Khử trùng cùng với các thành phần khác của môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng bổ sung thêm hoặc khử trùng bằng lọc qua phin lọc.

Bảng 2.5. Nhóm các chất điều hoà sinh trưởng khác

Tên hóa chất

Phân tử lượng và tương đương

Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng

Phân tử lượng

Số µM = 1mg/L

Dung môi

Pha loãng

Bảo quản

Bảo quản lỏng

Khử trùng

Nồng độ sử dụng (mg/L)

(⁺_-)-cis,trans-Abscisic acid (ABA)

264.3

3.78

1N NaOH

Nước

-0⁰C

CA/F

0.1-10.0

Ancymidol

256.3

3.90

DMSO

—

2-8⁰C

-0⁰C

CA/F

1.0-10.0

Chlorocholine chloride (CCC)

158.1

6.33

Nước

—

2-8⁰C

up to 500

3,6-Dichloro-o-anisic acid (Dicamba)

221.0

4.52

EtOH/ Nước

—

2-8⁰C

0.01-10.0

Gibberellic acid (GA₃)

346.4

2.89

EtOH

—

2-8⁰C

CA/F

0.01-5.0

Gibberellic acid Potassium salt (K-GA₃)

384.5

2.60

Nước

—

2-8⁰C

-0⁰C

CA/F

0.01-5.0

Gibberellin A₄Free acid (GA₄)

332.4

3.01

EtOH

—

-0⁰C

0.01-5.0

(⁺_-)-Jasmonic acid

210.3

4.76

EtOH

—

2-8⁰C

-0⁰C

0.01-100.0

Phloroglucinol

126.1

7.93

Nước

—

2-8⁰C

CA/F

> 162

N-(Phosphonomethyl)glycine (Glyphosate)

169.1

5.91

1N NaOH

Nước

2-8⁰C

—

Succinic acid 2,2-dimethylhydrazide

160.2

6.24

Nước

—

2-8⁰C

CA/F

0.1-10.0

Bảng 2.6. Giới thiệu tóm tắt về một số chất điều hoà sinh trưởng chính ở thực vật

A	Nhóm auxin	Chức năng trong hệ thống nuôi cấy mô
1	Indole-3-acetic acid (IAA)	- Phân chia tế bào - Tạo và nhân callus - Tạo rễ bất định(ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định(ở nồng độ thấp) - Tạo phôi soma (2,4-D) - ức chế chồi nách
2	Indole-3-butyric acid (IBA)
3	1-naphthaleneacetic acid (NAA)
4	2,4-dichlorophenoxy- acetic acid (2.4D)
5	(2,4,5-T)
6	Picloram
7	Dicamba
8	p-chlorophenoxy- acetic acid (CPA)
9	Phenylacetic acid (PAA)
B	Nhóm cytokinin	Chức năng trong hệ thống nuôi cấy mô
1	Kinetin	- Phân chia tế bào - Tạo và nhân callus - Kích thích bật chồi nách. - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi. - ức chế quá trình già (hoá vàng) ở lá.
2	6-Bezylamino- purine (BAP)
3	Zeatin (Z)
4	Zeatinriboside (ZR)
5	Isopentenyladenosine (iPA)
6	Isopentenyladenine (iP)
7	Thidiazuron (TDZ)
8	N-(2-chloro-4-pyridyl) -N-phenylurea (CPPU)
C	Nhóm gibberellin	Chức năng trong hệ thống nuôi cấy mô
1	Gibberellic acid (GA3)	- Kéo dài chồi - Phá ngủ ở hạt giống. - ức chế sự hình thành rễ bất định. - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ).
2	Gibberllin 1 (GA1)
3	Gibberellin 4 (GA4)
4	Gibberellin 7 (GA7)
D	Nhóm các chất ĐHST khác	Chức năng trong hệ thống nuôi cấy mô
1	Ethylene	- Gây già hoá lá - Làm chín quả
2	Abscisic acid	- Sự chín của thể phôi - Kích thích sự hình thành thân hành và thân củ - Thúc đẩy sự phát triển của tình trạng ngủ
3	Nhóm Polyamine	- Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự hình thành chồi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi.
a	Putrescin
b	Spermidine
c	Sspermine
4	Jasmonic acid (Ja) Methyl jasmonate (MeJa)	- Kích thích sự hình thành thân củ và thân hành - Đẩy nhanh sự hình thành đỉnh sinh trưởng.

Bảng 2.7. Hướng dẫn các phương pháp pha hoá chất, khử trùng và bảo quản các chất dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Tên hoá chất	Dung môi hoà tan		Cách khử trùng	Nhiệt độ bảo quản
AUXIN
2,4-D	50% EtOH		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
IAA	1N NaOH		Hấp khử trùng	-0⁰C
IBA	1N NaOH		Hấp khử trùng	0-5⁰C
NAA	1N NaOH		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
NAA Solution			Hấp khử trùng	0-5⁰C
CYTOKININ
Adenine	H₂O		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
BA	1N NaOH		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
BA Commercial Grade	1N NaOH		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Ba solution	-		Hấp khử trùng	0-5⁰C
1,3-Diphenylurea	DMSO		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
2Ip	1N NaOH		Hấp khử trùng	-0⁰C
2iP Solution	-		Hấp khử trùng	-0⁰c
2iP Riboside		Phin lọc		-0⁰c
Kinetin		Hấp khử trùng		-0⁰c
Kinetin thương mại		Hấp khử trùng		-0⁰c
Dung dịch kinetin		Hấp khử trùng		-0⁰c
Kinetin Riboside		Phin lọc		-0⁰c
Zeatin Riboside (trans)		Phin lọc		-0⁰c
Các chất ĐHST khác
(±) ABA	1N NaOH		Phin lọc	-0⁰c
GA₃	50%EtOH		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Phloroglucinol	EtOH/H₂O		Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Succinic Acid
2,2-Dimethydrazide	H₂O		Hấp khử trùng	0-5⁰C
Kháng sinh (ANTIBIOTIC)
Amphotericin B	DMF/H₂O		Phin lọc	0-5⁰C

Tên hoá chất Dung môi hoà tan Cách khử trùng Nhiệt độ bảo quản

Carbenicinllin	H₂O	Phin lọc	0-5⁰C
Cefotaxime	H₂O	Phin lọc	0-5⁰C
Chloramphenicol	EtOH/H₂O	Phin lọc	Nhiệt độ phòng
Gentamicin sulfate	H₂O	Phin lọ	0-5⁰C
Kanamycin monosulfate	H₂O	Phin lọc	Nhiệt độ phòng
Nystatin	Insoluble	Phin lọc	-0⁰C
Rifampicin	EtOH/H₂O/ DMSO	Phin lọc	-0⁰C
Vancomycin. HCL	H₂O	Phin lọc	0-5⁰C
Các hoá chất khác
Colchicine	H₂O	Phin lọc	Nhiệt độ phòng
Folic Acid	1N NaOH	Hấp khử trùng	0-5⁰C
Riboflavin	H₂O	Phin lọc	Nhiệt độ phòng
Mannitol	H₂O	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Sorbitol	H₂O	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
L-Tryptophan	1N NaOH	Phin lọc	Nhiệt độ phòng
MES	H₂O	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Ca-Pantothenate	H₂O	Phin lọc	0-5⁰C
Pepton	H₂O	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
l-Ascorbic Acid	H₂O	Phin lọc	Nhiệt độ phòng
Biotin	H₂O	Hấp khử trùng	-0⁰C
Citric Acid	H₂O	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
EDTA (Na₂)	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
EDTA (FeNA₂)	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Ferrric Sulfate	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Ferric Tartrate	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Ferrous Sulfate	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Manganese	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng
Potasssium Phosphate	H₂O/ Nhiệt	Hấp khử trùng	Nhiệt độ phòng

Bảng 2.8. Phương pháp tính tương đương giữa nồng độ phần triệu (ppm= part per million= 1 mg/l) và nồng độ phân tử gam của một số chất

Nồng độ ppm = mg/l	Nồng độ phân tử gam (x 10^-6M)
Nồng độ ppm = mg/l	2,4-D	NAA	IAA	BA	kinetin	GA₃
1	5. 371	4. 524	5. 708	4. 439	4. 439	2. 887
2	10. 741	9. 048	11. 417	8. 879	9. 293	5. 774
3	16. 112	13. 572	17. 125	13. 318	13. 940	8. 661
4	21. 483	18. 096	22. 834	17. 757	18. 586	11. 548
5	26. 853	22. 620	28. 542	22. 197	23. 231	14. 435
6	32. 223	27. 144	34. 250	26. 636	27. 880	17. 323
7	37. 594	31. 668	39. 959	31. 075	32. 526	20. 210
8	42. 965	36. 193	45. 667	35. 515	37. 173	23. 097
9	48. 339	40. 717	51. 376	39. 954	41 .820	25. 984
Phân tử lượng (mol Wt)	186.20	211.04	175.18	225.26	215.21	346.37

Ví dụ, cách tra bảng nồng độ của 5 ppm (5 mg/l) của IAA sẽ tương đương với nồng độ phân tử gam trên bảng là 28.542 x 10^-6M:

Nồng độ IAA: 5 ppm = 28,542 x 10^-6M

Nồng độ BA: 8 ppm = 35,515 x 10^-6M

Nồng độ NAA: 10 ppm = 10 x 5,371 x 10^-6M = 53,71 àM

Chuyển đổi đơn vị đo: 10^-6M = 10^-3mM = 1M 53

Bảng 2.9. Cách tra cứu từ nồng độ phân tử gam tính sang nồng độ phần triệu (ppm) hoặc (1 mg/l) của một số chất (ppm = 1 mg/l)

Nồng độ phân tử gam (10^-6M)	Nồng độ ppm = mg/l
Nồng độ phân tử gam (10^-6M)	NAA	2,4-D	IAA	BA	Kinetin	GA₃
1	0.1862	0.2210	0.1752	0.2253	0.2152	0.3464
2	0.3724	0.4421	0.3504	0.4505	0.4304	0.6927
3	0.5586	0.6631	0.5255	1.6758	0.6456	1.0391
4	0.7448	0.8842	0.7007	0.9010	0.8608	1.3855
5	0.9310	1.2052	0.8759	1.1263	1.0761	1.7319
6	1.1172	1,3262	1.0511	1.3516	1.2913	2.0782
7	1.3034	1.5473	1.2263	1.5768	1.5065	2.4246
8	1.4896	1.7683	1.4014	1.8021	1.7217	2.7710
9	1.6758	1.9894	1.5766	1.0273	19369	3.1173
Mol Wt	186.20	211.04	175.18	225.26	215.21	346.37

Ví dụ:

Nồng độ kinetin 3 x 10^-6M = 0.6456 ppm

Nồng độ IAA 9 x 10^-6M = 1.5766 ppm

Cách chuyển đổi đơn vị đo khi nồng độ phân tử gam là một số lẻ:

Ví dụ: Nồng độ BA 4.5 x 10^-6M = 0.9010 ppm + 1.1263 - 0.9010 ppm

= 0.9010 ppm + 01127 ppm

= 1.0137 ppm

=ppm

2.6.1.7. Các chất kháng sinh

Chất kháng sinh là chất được sản xuất bởi các loài vi sinh vật khác nhau, hoặc là các chất kháng sinh tổng hợp. Chúng có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác và cuối cùng làm tiêu huỷ chúng.

Các kháng sinh (antibiotics)

Bổ sung các kháng sinh vào môi trường nuôi cấy nói chung thường được tránh do sự hiện diện của chúng trong môi trường làm chậm sinh trưởng của mô và tế bào. Tuy nhiên, một số tế bào thực vật bị nhiễm một cách hệ thống các vi sinh vật. Để ngăn chặn sinh trưởng của bọn vi sinh vật này, điều không thể thay thế là làm giàu môi trường bằng kháng sinh. Streptomycin hoặc kanamycin ở nồng độ thấp kiểm soát hiệu quả hiện tượng nhiễm có tính hệ thống và môi trường được bổ sung các kháng sinh này không gây bất lợi cho sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy.

Vai trò của các loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật:

- Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật
- Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy
- Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô nuôi cấy (sau nuôi cấy, hỗn hợp Agrobacterium với tế bào thực vật để chuyển gen hoàn thành).
- Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh). Các tế bào không được chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh ở nồng độ thích hợp.

2.6.1.8. Các chất khử trùng

Sự phát triển của nấm và vi khuẩn rất bất lợi cho quá trình nuôi cấy. Để tránh điều này mẫu cấy phải được khử trùng bề mặt bằng chất khử trùng trước khi cấy. Những dung dịch dùng để khử trùng vật liệu được kê ở bảng 15 với nồng độ và thời gian thích hợp vưà đủ để tiêu diệt sự nhiễm nấm khuẩn đồng thời không làm chết mô nuôi cấy.

Quy trình khử trùng bề mặt

1. Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịch khử trùng.
2. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10 - 30 phút.
3. Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng.
4. Chắt dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng.

Quy trình khử trùng có thể được tăng cường thêm bằng cách:

1. Tráng vật liệu trong dung dịch cồn 70% trước khi khử trùng bằng một loại dung dịch khử trùng khác. Phương pháp hai bước (hai nguồn) này tỏ ra có hiệu quả với một số loài.
2. Sử dụng thêm dung dịch xúc tác như Tween 20 hay 80 vào dung dịch khử trùng để làm giảm trạng thái căng bề mặt và làm bề mặt mẫu có khả năng tiếp xúc tốt hơn với chất khử trùng.
3. Khử trùng trong điều kiện chân không có tác dụng đối với việc khử bọt khí và tăng thêm hiệu quả cho quá trình khử trùng.

Quy trình khử trùng thường được áp dụng:

1. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy khoảng 30 phút.
2. Nhúng ngập mẫu trong cồn 70%.
3. Ngâm mẫu trong dung dịch CLOROX 10% cộng với 2 - 3 giọt Tween 20 trong 15 phút.
4. Ngâm mẫu trong dung dịch CLOROX 5% cộng với 2 - 3 giọt Tween 20 trong 10 phút.
5. Rửa lại mẫu 3 lần với nước cất vô trùng.

Bảng 2.10. Những dung dịch khử trùng phổ biến dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chất khử trùng	Nồng độ (%)	Thời gian khử trùng (phút)
Calcium hypocholorite	9 - 10	5 - 30
Sodium hypocholorite	0.5 - 5	5 - 30
Hydrogen peroxide	3 - 12	5 - 15
Bromine water	1 - 2	2 - 10
Ethyl alcohol	70 - 95	0.1 - 5.0
Silver nitrate	1	5 - 30
Murcuric choloride	0.1 - 1.0	2 - 10
Benzalkonium choloride	0.01 - 0.1	5 - 20
Antibiotics	4 - 50 mg/l	30 - 60

2.6.2. Độ pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp.

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy callus của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5-6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0-6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5-6,5.

Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc.

Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng. Nhìn chung nếu độ PH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn 5 thì agar khó đông.

2.6.3. Các tác nhân làm rắn môi trường

Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị các môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static conditions).

Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ-Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác. Trước tiên, gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường. Thứ hai, chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5-1% agar được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng, việc sử dụng agar được tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60^oC trong 24 giờ. Nói chung, ở 80^oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 40^oC trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6-12 g/L nước.

Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25^oC). Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-rite. Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một loại agarose được tinh sạch cao gọi là Sea Plaque(k), loại này có thể được dùng để phục hồi các protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter paper wick), bọt polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester (polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào.

Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chất tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25-2,5 g/L) và nó có thể giúp phát hiện sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy. Các mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau.

2.7. Một số loại môi trường cơ bản

Thành phần cơ bản của một số loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật được trình bày trong bảng 2.1. Môi trường Murashige-Skoog (MS) là một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm. Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trường B5 được thiết kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast. Môi trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trường Chu (N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, được phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được phát minh bởi Nitsch (1969) vẫn được dùng phổ biến hơn. Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ biến trong nuôi cấy cây đậu tương, cỏ ba lá đỏ (red clover) và các loài legume khác. Thành phần dinh dưỡng của môi trường này đã giúp tăng sinh trưởng của tế bào trong quá trình phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast.

Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Cho đến nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu. Lịch sử ra đời của các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật được liệt kê ở bảng 2, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến (bảng 3), đặc biệt là các môi trường như MS, LS, B5 và WP. Thành phần hoá học của các môi trường này được thể hiện ở các bảng 4, 5, 6 và 7. Các chất điều hoà sinh trưởng đóng vai trò quyết định đối với phát sinh hình thái, phân chia và phân hoá tế bào, hình thành mô và cơ quan như phát chồi và tạo rễ. Đôi khi thay đổi nồng độ các chất khoáng của môi trường cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển các giai đoạn phát triển khác nhau của quá trình nuôi cấy.

Bảng 2.11. Một số môi trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Thành phần	Murashige & Skoog (1962)	White(1963	Gamborg(1968)	Nitsch (1951)	Heller (1953)	Schenk & Hildeb (1972)	Nitsch & Nitsch (1967)	Kohlenbach & Schmidt (1975)	Knop (1865)
(NH₄)₂SO₄	-	-	134	-	-	-	-	-	-
MgSO_4ì7H₂O	370	720	500	250	250	400	125	185	250
Na₂SO₄	-	200	-	-	-	-	-	-	-
KC1	-	65	-	1,500	750	-	-	-	-
CaC1_2ì2H₂O	440	-	150	25	75	200	-	166	-
NaNO₃	-	-	-	-	600	-	-	-	-
KNO₃	1,900	80	3,000	2,000	-	2,500	125	950	250
Ca(NO₃)_2ì4H₂O	-	300	-	-	-	-	500	-	1,000
NH₄NO₃	1,650	-	-	-	-	-	-	720	-
NaH₂PO_4ìH₂O	-	16.5	150	250	125	-	-	-	-
NH₄H₂PO₄	-	-	-	-	-	300	-	-	-
KH₂PO₄	170	-	-	-	_	-	125	68	250
FeSO_4ì7H₂)	27.8	-	27.8	-	-	15	27.85	27.85	-
Na₂EDTA	1	-	37.3	-	-	20	37.25	37.25	-
MnSO_4ì4H₂O	22.3	7	10 (1 H₂O)	3	0.1	10	25	25	-
ZnSO_4ì7H₂O	8.6	3	2	0.5	1	0.1	10	10	-
CuSO_4ì5H₂O	0.025	-	0.025	0.025	0.03	0.2	0.025	0.025	-
H₂SO₄	-	-	-	0.5	-	-	-	-	-
Fe₂(SO₄)₃	-	2.5	-	-	-	-	-	-	-
NiC1_2ì6H₂O	-	-	-	-	0.03	-	-	-	-
CoC1_2ì6H₂O	0.025	-	0.025	-	-	0.1	0.025	-	-
A1C1₃	-	-	-	-	0.03	-	-	-	-
FeC1_3ì6H₂O	-	-	-	-	1	-	-	-	-
FeC₆O₅H_7ì5H₂O	-	-	-	10	-	-	-	-	-
K1	0.83	0.75	0.75	0.5	0.01	1.0	-	-	-
H₃BO₃	6.2	1.5	3	0.5	1	5	10	10	-
Na₂M₀O_4ì2H₂O	0.25	-	0.25	0.25	-	0.1	0.25	0.25	-

Bảng 2.12. Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)

Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497.

Muối khoáng	Nồng độ		Nồng độ
Đa lượng	(mg/l)	Vi lượng		(mg/l)
Potasium nitrate (KNO₃)	1,900	Manganese sulfate (MnSO₄. 4H₂O)		22.3
Amonium nitrate (NH₄NO₃)	1,650	Boric Acid (H₃BO₃)		6.2
Calcium chloride (CaCl₂.H₂O)	440	Colbalt chloride (CoCl₂.6H₂O)		0.025
Magnesium sulfate (MgSO₄.7H₂O)	370	Cupric Sulfate (CuSO₄.5H₂O)		0.025
Potassium phosphate (KH₂PO₄)	170	Ferrous sulfate (FeSO₄.7H₂O)		27.8
Potassium Iodine (KI)		0.83
Sodium molybdate (Na₂MoO₄.2H₂O)		0.25
Zinc Sulfate (ZnSO₄.7H₂O)		8.6
Na₂EDTA.2H₂O		37.2
Các chất hữu cơ
Myo-inositol	100 mg/l	Nicotinic aAcid		0.5 mg/l
Pyridoxine HCl	0.5 mg/l	Thiamine HCl		0.1 mg/l
IAA	1-30 mg/l	Kinetin		0.04-10
Glycine (recrytallized)	2.0 g/l	Edamine		1.0 g/l
Sucrose	20 g/l	Agar		10 g/l

Bảng 2.13 . Môi trường LS (Linsmaier & Skoog, 1965)

Linsmaier, E.M. and Skoog, F., 1965. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 18,100-127.

Muối khoáng	Nồng độ		Nồng độ
Đa lượng	(mg/l)	Vi lượng		(mg/l)
Amonium nitrate (NH₄NO₃)	1,650	Boric acid (H₃BO₃)		6.2
Calcium chloride (CaCl₂.H₂O)	440	Colbalt chloride (CoCl₂.6H₂O)		0.025
Magnesium sulfate (MgSO₄.7H₂O)	370	Cupric sulfate (CuSO₄.5H₂O)		0.025
Potassium nitrate (KNO₃)	1,900	Ferrous sulfate (FeSO₄.7H₂O)		27.8
Potassium phospate (KH₂PO₄)	170	Manganese sulfate (MnSO₄.4H₂O)		22.3
Potassiom iodine (KI)		0.83
Sodium molybdate (Na₂MoO₄.2H₂O)		0.25
Zinc sulfate (ZnSO₄.7H₂O)		8.6
Na₂EDTA		37.3
Các chất hữu cơ
myo-Inositol	100 mg/l	Thiamine.HCl		0.4 mg/l
IAA	1-30 mg/l	Kinetin		0.001-10 mg/l
Sucrose	30g/l	Agar		10g/l
Các chất bổ sung (thay đổi tuỳ theo mục đích và đối tượng nghiên cứu)
Aminobenzoic acid	0.1 mg/l	Tyrosine		100 mg/l
Gibberellic acid	1.0 mg/l	Casein hydrolysate		1-3 g/l
Adenine sulfate	40 mg/l	Cytidylic acid		200 mg/l
Guanylic acid	200 mg/l	L-Asparagine		500 mg/l
L-Glutamine		500 mg/l

Bảng 2.14. Môi trường B5 (Gamborg cs., 1976)

Gamborg, O.L., Murashige, T., Thorpe, T.A., and Vasil, I.K., 1976. Plant tissue culture media in vVitro, 12, 473-478.

Muối khoáng	Nồng độ		Nồng độ
Đa lượng	mg/l	Vi lượng	mg/l
Amonium sulfate ((NH4)₂SO₄)	134	Boric acid (H₃BO₃)	3.0
Calcium chloride (CaCl_2.H₂O)	150	Colbalt chloride (CoCl₂.6H₂O)	0.025
Magnesium sulfate (MgSO₄.7H₂O)	246	Cupric Sulfate (CuSO₄.5H₂O)	0.025
Potassium nitrate (KNO₃)	2,528	Ferrous sulfate (FeSO₄.7H₂O)	27.8
Manganese sulfate, monohydrate (MnSO₄.H₂O)		10
Potassiom iIodine (KI)		0.75
Sodium molybdate (Na₂MoO₄.2H₂O)		0.25
Sodium phosphate (NaH₂PO₄.H₂O)		150
Zinc sulfate (ZnSO₄.7H₂O)		2.0
Na₂EDTA.2H₂O		37.2
Các chất hữu cơ
myo-Inositol	100 mg/l	Nicotinic Acid	1.0 mg/l
PyridoxineHCl	1.0 mg/l	ThiamineHCl	10 mg/l
2,4-D	0.1-1.0 mg/l	Kinetin	0.1 mg/l
Sucrose		20 g/l

Bảng 2. 15. Môi trường WPM - Woody Plant Medium

(Lloyd and McCown, 1980)

Lloyd, G. B. and McCown, B. H., 1980. Commercial Feasible Micropropagation of Mountain Laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proceeding of Int. Plant. Propagators Society, 30, 421-427.

Muối khoáng	Nồng độ		Nồng độ
Đa lượng	mg/l	Vi lượng		mg/l
Amonium nitrate (NH₄NO₃)	400	Boric Acid (H₃BO₃)		6.2
Calcium nitrate (Ca(NO₃)₂.4H₂O)	556	Zinc sulfate (ZnSO₄.7H₂O)		8.6
Calcium chloride (CaCl₂. 2H₂O)	96	Na₂EDTA.2H₂O		37.2
Magnesium sulfate (MgSO₄.7H₂O)	370	Cupric Sulfate (CuSO₄.5H₂O)		0.25
Potassium sulfate (K₂SO₄)	990	Ferrous sulfate (FeSO₄.7H₂O)		27.8
Potassium phospate (KH₂PO₄)	170	Manganese sulfate (MnSO₄.4H₂O)		22.3
Sodium molybdate (Na₂MoO₄.2H₂O)		0.25
Các chất hữu cơ
Myo-inositol	100 mg/l	Nicotinic acid		0.5 mg/l
PyridoxineHCl	0.5 mg/l	Thiamine HCl		1.0 mg/l
Glycine	2.0 mg/l	Agar		6.0 g/l
Sucrose		20 g/l

2.8. Một số thuật ngữ cơ bản trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

- Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học (biotechnology).

- Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa (synonymous) là nuôi cấy in vitro (in vitro culture).

Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt).

Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative or somatic regeneration) cơ bản trong nhân giống in vitro và nuôi cấy mô:

- Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture)

Phương thức nhân giống bằng cách dùng các bộ phận rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot-tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó. Kiểu nuôi cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus (virus-free) ở thực vật. Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting).

-Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation)

Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự kéo dài của chồi ngọn (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh. Sự điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro (microshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro.

- Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction)

Loại nuôi cấy này cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật.

-Phát sinh cơ quan (organogenesis)

Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình phát triển các chồi, rễ bất định từ các khối tế bào callus. Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo callus.

- Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis)

Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic embryogenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis).

- Bảo quản lạnh sâu (cryopreservation): Bảo quản tế bào, mô, phôi, hạt ở nhiệt độ siêu lạnh, thường là -100^oC.

- Biến nạp bằng điện (electroporation): Kỹ thuật dùng dòng điện tạo những lỗ thủng trên màng tế bào để chuyển nạp những vật lạ, đặc biệt là DNA từ ngoài vào trong tế bào.

- Biến đổi dòng giao tử (gametoclonal variation): Biến đổi kiểu hình không do kiểu nhân hoặc ngoại biến mà do nguồn gốc giao tử gây nên.

- Biến nạp (transformation): Quá trình đưa vào và dung nạp một cách chắc chắn DNA lạ vào trong tế bào thực vật bất luận bằng cách gì để có được một biến đổi di truyền thì đều được coi là biến nạp thành công.

- Biến nạp in vitro (in vitro transformation): Biến đổi di truyền ở tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro dưới tác động của các tác nhân khác nhau như chất gây ung thư, chiếu xạ, virus, vi khuẩn gây biến đổi di truyền.

- Bội thể đúng (euploid): Trạng thái bội thể mà tế bào có số lượng nhiễm sắc thể đúng bằng bội số của số nhiễm sắc thể đơn bội.

- Cảm ứng (induction): Hormone gây tạo một loại cấu trúc, bộ phận hay một quá trình nào đó trong điều kiện in vitro.

- Cấy chuyền (passage hoặc subculture): Chuyển tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy sang bình nuôi có chứa môi trường mới pha kết hợp với tách nhỏ hoặc làm loãng mật độ để nhân số lượng.

- Chồi hoặc rễ bất định (adventitious roots or shoots): Là những chồi hoặc rễ phát sinh từ những vùng khác thường, không phải là hợp tử.

- Chủng phụ (substrain): Được tách và nhân từ một nhóm tế bào của một chủng với những tính trạng mà chủng bố mẹ đó không có.

- Chủng tế bào (cell strain): Chủng tế bào gồm những tế bào có đặc điểm riêng biệt được chọn từ nuôi cấy khởi sinh hay dòng tế bào có trước. Thường phải nêu rõ nguồn gốc của chủng tế bào trong các công bố khoa học nhất là khi các chủng đó có nguồn gốc từ các phòng thí nghiệm khác.

- Con lai tế bào soma (somatic cell hybrid): Tế bào hoặc cây hoàn chỉnh tạo được do lai tế bào trần (protoplast) với đặc tính di truyền khác nhau.

- Dị bội (heteroploid): Tình trạng các tế bào trong một thí nghiệm nuôi cấy có bộ nhiễm sắc thể ở nhiều mức bội thể khác nhau. Khái niệm này dùng cho một cơ thể đa bào hay nuôi cấy gồm nhiều tế bào.

- Dị nhân (heterokaryon): Một tế bào có hai hay nhiều nhân khác nhau ở trong một tế bào chất chung, thông thường là do dung hợp tế bào tạo thành.

- Di truyền tế bào chất (cytoplasmic inheritance): Hiện tượng di truyền do các gen ở ngoài nhân quyết định, ví dụ: gen của lục lạp, ty thể hay plasmid.

- Di truyền học tế bào soma (somatic cell genetics): Ngành khoa học chuyên nghiên cứu về di truyền của tế bào soma, phần lớn là tế bào trong nuôi cấy in vitro.

- Đỉnh sinh trưởng chồi ngọn (shoot apical meristem): Mô chưa phân hóa hình chóp nằm trong các mầm lá ở chồi ngọn, khi tách không lớn quá 0,1 mm.

- Độ xốp lỏng (friability): Tình trạng không liên kết của các tế bào thực vật trong khối mô sẹo. Mô sẹo xốp lỏng rất khó tái sinh cây hoàn chỉnh.

- Dòng (clone): Tập hợp các cá thể nhân được bằng phương thức nhân giống vô tính từ một cá thể duy nhất.

- Dòng giao tử (gametoclone): Những thực vật được tạo ra từ giao tử, bào tử giảm nhiễm hoặc thể giao tử.

- Dòng tế bào (cell line): Khái niệm để chỉ sự nuôi cấy của những tế bào có nguồn gốc chung từ lần cấy chuyển đầu tiên.

- Dung hợp tế bào trần (protoplast fusion): Kỹ thuật làm cho hai hay nhiều protoplast dung hợp với nhau thành một tế bào.

- Đột biến (mutation): Biến đổi kiểu hình do thay đổi gen hay do gen mới.

- Đồng nhân (homokaryon): Tế bào có chứa hai hay nhiều nhân đồng nhất về mặt di truyền ở trong một tế bào chất chung. Thường là sản phẩm hình thành sau dung hợp tế bào.

- Già hóa (senesence): Biểu hiện mất khả năng phân chia của tế bào và mô trong nuôi cấy.

- Giai đoạn I (stage I): Trong nhân giống in vitro giai đoạn I là thời kỳ khởi đầu tạo nguyên liệu vô trùng cho nuôi cấy.

- Giai đoạn II (stage II): Trong nhân giống in vitro giai đoạn II là thời kỳ nhân nhanh về số lượng mô, phôi, rễ trong bình nuôi.

- Giai đoạn III (stage III): Trong nhân giống in vitro giai đoạn III là thời kỳ chuẩn bị cho cây giống đủ điều kiện chuyển ra ngoài đất. Thời kỳ này bao gồm việc tạo rễ cho cây, thích nghi điều kiện ngoại cảnh và bắt đầu chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng.

- Giai đoạn IV (stage IV): Trong nhân giống in vitro đây là giai đoạn chuyển cây từ điều kiện bình nuôi sang điều kiện tự nhiên trồng trên đất. Có nhiều loại cây có thể chuyển trực tiếp từ giai đoạn II sang giai đoạn IV.

- Hiện tượng bổ sung di truyền (complementation): Hiện tượng hai khuyết tật di truyền có khả năng hỗ trợ lẫn nhau làm cho tính trạng khiếm khuyết đó mất đi.

- Hiệu suất bám (attachment efficiency): Phần trăm số tế bào bám được lên bề mặt môi trường nuôi cấy trong một thời gian nhất định.

- Hiệu suất nuôi trải (plating efficiency): Khái niệm này đồng nghĩa với hiệu suất tạo dòng, nói lên phần trăm số tế bào phát triển thành dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trường.

- Hiệu suất tạo dòng (cloning efficiency): Phần trăm số tế bào đã tạo được dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trường.

- Hợp bào sinh chất (cybrid): Tế bào sống tạo được khi dung hợp thể sinh chất (không có nhân) với một tế bào. Đó là thể lai tế bào chất.

- Hợp bào recon (recon, reconstituted cell hay reconstructed cell): Hợp bào sống bình thường được tạo khi dung hợp thể nhân của tế bào này với thể nguyên sinh chất của tế bào khác.

- Kỹ thuật vô trùng (aseptic technique): Qui trình ngăn ngừa sự nhiễm nấm, vi khuẩn, siêu vi khuẩn hoặc các loại vi sinh vật khác đối với nuôi cấy mô và tế bào.

- Lai tế bào (cell hybridization): Sự dung hợp hai hay nhiều tế bào không giống nhau để tạo một thể tế bào hỗn hợp (synkaryon).

- Lai tế bào soma (somatic cell hybridization): Quá trình dung hợp protoplast của tế bào soma động vật hay thực vật có đặc tính di truyền khác nhau.

- Lần cấy chuyển (passage number): Số lần tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy được cấy chuyển, qua đó có thể tính tuổi và hệ số đẳng trương của chúng.

- Lệch bội (aneuploidy): Tình trạng bộ nhiễm sắc thể của tế bào mang số lượng nhiễm sắc thể khác với bội số của bộ nhiễm sắc thể đơn bội. Có thể là dư hoặc thiếu một hay nhiều nhiễm sắc thể.

- Lưỡng bội giả (pseudodiploid): Lưỡng bội hay nhị bội giả là thể nhị bội, nhưng do sắp xếp mỗi nhiễm sắc thể mất khả năng tạo đôi trong khi phân bào.

- Mật độ quần thể (population density): Số lượng tế bào trên đơn vị diện tích nuôi cấy hay trên đơn vị thể tích nuôi cấy.

- Mẫu vật (explant): Mô được tách từ nguyên liệu ban đầu dùng để duy trì hoặc nuôi cấy.

- Môi trường nhân tạo (chemically difined medium): Dung dịch dinh dưỡng dùng để nuôi cấy chỉ chứa những thành phần mà cấu trúc hóa học đã được biết.

- Mô sẹo (callus): Khối mô thực vật gồm những tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia, được phát sinh từ các tế bào đã phân hóa ít nhiều. Khi thực vật bị thương tổn thường tạo loại mô này trên vết sẹo, vì thế có tên gọi là mô sẹo.

- Ngoại biến (epigenetic variation): Hiện tượng biến đổi kiểu hình, nhưng không biến đổi kiểu gen. Ngoại biến có thể do sự thay đổi của quá trình methyl hóa DNA trong quá trình phiên mã và dịch mã hay sự biến đổi sau dịch mã.

- Nhân dòng (clonal propagation): Nhân giống vô tính những dòng thực vật có nguồn gốc từ một cá thể hay một mảnh cắt duy nhất, đảm bảo hoàn toàn đồng nhất về di truyền.

- Nhân giống in vitro (in vitro propagation): Nhân giống một loài thực vật trong ống nghiệm (bình thuỷ tinh, bình plastic, hộp plastic,...) trên môi trường nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Đồng nghĩa với khái niệm micropropagation.

- Nhân giống vô tính (vegetative propagation): Nhân giống không thông qua quá trình sinh sản hữu tính, bao gồm các kỹ thuật như: nhân giống in vitro, giâm các bộ phận cành, mảnh lá, đoạn rễ, chiết, ghép, tách gốc,...

- Nhị bội (diploid): Tình trạng bội thể mà tế bào có từng đôi tất cả các nhiễm sắc thể, trừ nhiễm sắc thể giới tính và hoàn toàn giống bộ nhiễm sắc thể của loài đó ở ngoài tự nhiên.

- Nhiễm biến (transfection): Khái niệm này trước đây được dùng trong vi sinh vật học để chỉ quá trình biến nạp gen trực tiếp bằng DNA của virus vào tế bào. Tới nay khái niệm này được mở rộng để chỉ quá trình biến nạp gen bằng DNA tinh khiết không phân biệt nguồn gốc.

- Nuôi cấy đỉnh ngọn (shoot tip (apex) culture): Sử dụng đỉnh sinh trưởng chồi ngọn cùng với một hai mầm lá với tổng kích thước từ 0,1 đến 1,0 mm.

- Nuôi cấy cơ quan (organ culture): Duy trì và phát triển toàn bộ hay một phần cơ quan động, thực vật trong điều kiện in vitro.

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture): Nuôi cấy mẫu mô hình chóp không lớn hơn 0,1 mm. Thường được tách từ rễ ngọn dưới kính hiển vi.

- Nuôi cấy huyền phù (suspension culture): Phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng.

- Nuôi cấy mô tissue culture): Duy trì và sinh trưởng các loại mô trong điều kiện in vitro nhằm điều khiển phân hóa về hình thái và chức năng của chúng.

- Nuôi cấy mô thực vật (plant tissue culture): Duy trì và nuôi dưỡng tế bào, mô, cơ quan, hay cây hoàn chỉnh của thực vật trong điều kiện in vitro.

- Nuôi cấy khởi đầu, nuôi cấy sơ cấp (primary culture): Nuôi cấy đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu tính đến khi cấy chuyển hữu hiệu lần đầu, từ đó sẽ thu được dòng tế bào.

- Nuôi cấy phôi (embryo culture): Duy trì và phát triển phôi non hoặc đã trưởng thành được phân lập từ hạt.

- Nuôi cấy tế bào (cell culture): Khái niệm chỉ những nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) của những tế bào kể cả tế bào đơn không phân hóa thành mô.

- Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) : Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic embryogenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis).

- Phân hóa (differentiation): Quá trình chuyên môn hóa các tế bào về chức năng và hình thái để tạo ra các loại mô, cơ quan và cơ thể hoàn chỉnh.

- Phân hóa hình thái (morphogenetic differentiation): Phân hóa riêng về mặt hình thái, chủ yếu nói đến sự hình thành chồi và rễ từ mô sẹo. Đồng nghĩa với phát sinh hình thái.

- Phân hóa phôi (embryogenesis): Quá trình hình thành phôi (phôi hóa) và phát triển phôi.

- Phát sinh cơ quan (organogenesis): Hiện tượng các cơ quan riêng biệt như chồi, lá, rễ hình thành trong nuôi cấy tế bào, mô sẹo hoặc mô khác. Hiện tượng này cũng xãy ra trong nuôi cấy tế bào động vật. Đây là kết quả của quá trình phân hóa hình thái hay phân hóa chức năng hay cả hai.

- Phát sinh hình thái (morphogenesis): Hiện tượng phát sinh và phát triển các cấu trúc giống hay không giống các cơ quan như chồi, rễ, lá từ tế bào, mô sẹo hay mẫu vật nuôi cấy.

- Sạch bệnh (pathogen free): Được kiểm định là không mang mầm bệnh.

- Sạch virus (virus free): Được kiểm tra bằng phép thử đặc hiệu chứng tỏ không mang loại virus đặc trưng cần phát hiện.

- Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation) :Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự kéo dài của chồi ngọn (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh. Sự điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro (microshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro.
- Tái sinh (regeneration): Hiện tượng tế bào hoặc mô nuôi cấy chịu tác động kích thích phân hóa thành mô, cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh.

- Tầng nuôi dưỡng (feeder layer) hoặc tế bào nuôi dưỡng (nurse cells): Lớp tế bào có thể đã bị chiếu xạ làm mất khả năng phân bào được trải bên dưới để cung cấp một số chất cần thiết cho lớp tế bào khác nuôi bên trên.

- Tạo phôi soma (somatic embyogenesis): Quá trình hình thành phôi từ tế bào không phải là tế bào sinh sản hay giao tử thể trong nuôi cấy in vitro.

- Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction): Loại nuôi cấy này cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật.

- Tế bào lai (hybrid cell): Là tế bào có một nhân được hình thành sau dung hợp hai tế bào dẫn đến sự hình thành một nhân hỗn hợp (synkaryon).

- Tế bào tiểu phần (microcell): Một phần nhỏ tế bào chứa vài ba nhiễm sắc thể, xuất hiện trong khi tiến hành kỹ thuật phá bỏ nhân tế bào.

- Tế bào trần (protoplast): Tế bào bị làm mất toàn bộ thành tế bào. Khái niệm này dùng cho cả thực vật, vi khuẩn và nấm, đương nhiên ở hai trường hợp cuối khi thành tế bào chưa bị loại hoàn toàn người ta dùng khái niệm "tế bào trụi" (spheroplast).

- Thể bào chất (cytoplast): Tế bào nguyên vẹn sau khi làm mất nhân.

- Thể lai tế bào chất (cytoplasmic hybrid): Đồng nghĩa với hợp bào sinh chất (cybrid).

- Thể nhân (karyoplast): Nhân tế bào thu được khi phân lập, được bọc bởi một lớp nguyên sinh chất rất mỏng và màng nguyên sinh.

- Thời gian tăng đôi quần thể (population doubling time): Thời gian mà số lượng tế bào của dòng hay chủng nuôi cấy tăng đến gấp đôi kể từ khi bắt đầu nuôi. Số lần gấp đôi quần thể trong một đợt nuôi cấy được tính bằng công thức sau:

Trong đó, N: số tế bào trong bình nuôi cấy khi kết thúc đợt nuôi, No: số tế bào trong bình khi bắt đầu nuôi. Lưu ý nên lấy số lượng tế bào sống hay bám được để tính. Thời gian tăng đôi quần thể là thời gian cần thiết để số lượng tế bào của quần thể đó tăng gấp đôi, ví dụ: từ 1.106 thành ra 2.106.

- Tính toàn năng (totipotency): Một đặc tính của tế bào là có khả năng phát triển thành mọi kiểu tế bào có trong cơ thể trưởng thành mà từ đó nó được tách ra, tức là có khả năng tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh.

- Trạng thái non trẻ (juvenile): Một giai đoạn phát triển trong chu trình sinh sản hữu tính của thực vật, phân biệt với giai đoạn trưởng thành là không phản ứng với các tác nhân kích thích ra hoa.

- Trạng thái tự sinh (habituation): Trạng thái phát triển không cần bổ sung chất điều khiển sinh trưởng ngoại sinh của một quần thể tế bào. Phân biệt với tự dưỡng.

- Tự dưỡng (autotrophy): Khả năng phát triển nhờ quang hợp không cần cung cấp một nguồn dưỡng chất chứa carbon hữu cơ. Ngược với dị dưỡng là bắt buộc phải bổ sung nguồn dưỡng chất hữu cơ vào môi trường sống.

- Tuổi thế hệ tế bào (cell generation time): Thời gian giữa hai lần phân chia của tế bào. Khái niệm này không đồng nghĩa với thời gian gấp đôi quần thể.

- Ức chế sinh trưởng phụ thuộc mật độ (density-dependent inhibition of growth): hiện tượng ức chế sinh trưởng bởi mật độ tế bào tăng lên.

- Vô trùng (asepsis): Không bị tạp nhiễm các loại vi khuẩn khác.

- Vi nhân giống (micropropagation) hay nhân giống (in vitro propagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ThS. Vưu Ngọc Dung

Каталог: Data -> News -> 388 -> files
News -> Nghị quyết của quốc hội số 23/2003/QH11 ngàY 26 tháng 11 NĂM 2003 VỀ nhà ĐẤT DO nhà NƯỚC ĐÃ quản lý, BỐ trí SỬ DỤng trong quá trình thực hiện các chính sáCH
News -> QuyếT ĐỊnh về việc ban hành Quy định về trang phục đối với Sinh viên Trường Đại học Lạc Hồng
News -> BỘ chính trị ĐẢng cộng sản việt nam
files -> Phần nuôi cấy tế BÀo chương giới thiệu chung và LỊch sử phát triểN
files -> Chương MỘt số phưƠng pháp canh tác hiệN ĐẠI 1 Thủy canh
files -> Phần chuyển gen ở thực vật bậc cao chương MỞ ĐẦU
files -> Chương nuôi cấy tế BÀo và chọn dòng tế BÀo nuôi cấy tế bào đơn
files -> Chương thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro phôi soma

tải về 1.2 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

1 2 3 4 5 6