600 ng/ml thì vẫn có hơn 40% bệnh nhân utg không được chẩn đoán

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm virut viêm gan B (HBV) an toàn và hiệu quả nhưng bệnh do nhiễm HBV vẫn đang là một vấn đề thách thức của y tế thế giới và trong nước. Ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 600.000 đến 1 triệu người chết do HBV. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Theo thống kê có 10-20% trong quần thể bình thường nhiễm HBV và có từ 20 đến 40% người nhiễm HIV có HBV (+). Ước tính đến năm 2025 nước ta có khoảng 8 triệu người nhiễm HBV, 58000 bệnh nhân xơ gan (XG), 25000 bệnh nhân ung thư gan (UTG) và có hơn 40000 người chết do nhiễm HBV.

Phần lớn các bệnh nhân UTG đều được phát hiện muộn, khi khối u đã hình thành, không còn khả năng cứu chữa. Do đó, việc phát hiện sớm UTG đang là một đòi hỏi bức thiết hiện nay. Thực vậy, hiện nay chẩn đoán UTG chủ yếu dựa vào: khám xét lâm sàng, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính và xét nghiệm AFP. Nhưng kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy ngay cả khi lấy giá trị ngưỡng của AFP là > 600 ng/ml thì vẫn có hơn 40% bệnh nhân UTG không được chẩn đoán.

Vì vậy, các dấu ấn phân tử là một trong những mục tiêu tìm hiểu được các nhà khoa học quan tâm hiện nay. Trong đó, đột biến các gen của HBV như HBx, Precore, Pre S..., hay các gen của người bệnh đã và đang là những dấu ấn được nghiên cứu nhiều nhất.

UTG là một bệnh được sinh ra do biến đổi gen qua nhiều giai đoạn. Trong số các gen được nghiên cứu thì gen TP53 là được quan tâm nhất. Gen này mã hóa cho protein P53 có chức năng điều hoà kiểm soát sự phát triển tế bào và ức chế sự hình thành u bằng con đường thúc đẩy tế bào chết theo chương trình và khả năng làm dừng sự phân chia của tế bào. Từ trước tới nay người ta chủ yếu quan tâm gen TP53 trong trường hợp UTG nhiễm Aflatoxin. Tuy nhiên, gần đây có nhiều bằng chứng cho thấy đột biến gen TP53 có liên quan chặt chẽ với nhiễm HBV trong sinh bệnh học UTG. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi bệnh nhân vừa nhiễm HBV vừa mang gen TP53 đột biến điểm 249^ser thì nguy cơ tiến triển thành UTG là 399 lần.

Ở Việt nam có một số tác giả đã nghiên cứu đột biến gen TP53 trên 1 số bệnh ung thư, nhưng các nghiên cứu về đột biến gen TP53 trên các bệnh do nhiễm HBV còn rất ít.

Vì những lý do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài "Nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen TP53 tại vị trí 249^ser và nồng độ protein P53 ở một số thể bệnh do nhiễm vi rut viêm gan B" nhằm các mục tiêu sau:

1. Xác định tỉ lệ đột biến gen TP53 tại vị trí 249^ser và mối liên quan của nó với một số thể bệnh do nhiễm virut viêm gan B.

2. Định lượng nồng độ protein P53 và tìm hiểu mối liên quan của nó với một số thể bệnh do nhiễm virut viêm gan B

Giới thiệu luận án:

* Cấu trúc luận án: Luận án có 107 trang, gồm các phần: Đặt vấn đề 2 trang; chương 1: Tổng quan: 35 trang; chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 trang; chương 3: Kết quả nghiên cứu 25 trang; chương 4: Bàn luận 23 trang; Kết luận 1 trang; Kiến nghị 1 trang; có 19 bảng; 24 biểu đồ; 21 hình. Có 149 tài liệu tham khảo; Tiếng Việt 38, Tiếng Anh 111; phần phụ lục có danh sách bệnh nhân và mẫu phiếu theo dõi bệnh nhân.

Đóng góp mới của luận án:

1. Là công trình đầu tiên nghiên cứu về đột biến gen TP53 trên các nhóm bệnh do nhiễm HBV (NMVR, VGM, XG, UTG) bằng phương pháp PCR - RFLP và khẳng định lại kết quả bằng giải trình tự gen.

2. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến gen TP53 tương đối thấp ở các nhóm, nhưng có thể liên quan đến tiến triển ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV.

3. Nồng độ protein P53 trong huyết tương khác nhau ở các thể bệnh do nhiễm HBV, và thấp nhất ở nhóm UTG và VGC.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cấu trúc của vi rut viêm gan B

Trên sợi DNA có bốn đoạn gen tương ứng với bốn khung đọc mở (KĐM - Open reading frame). Đây là các vùng được mã hóa để tổng hợp ra các protein của vi rut.

- KĐM S: KĐM S gồm vùng S và pre-S. Vùng pre-s được chia hai phần là pre-S1 và pre-S2. Đây là đoạn gen mã hóa tổng hợp các protein bề mặt (HBsAg).

- KĐM C mã hóa tổng hợp protein lõi (HBcAg) và HBeAg.

- KĐM P mã hóa tổng hợp enzym DNA polymerase. Sản phẩm của gen này là một enzym vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA lại xem như một enzym sao chép ngược (reverse transcriptase) mã hóa tổng hợp chuỗi DNA mới từ sợi RNA tiến bộ gen (pregenome).

- KĐM X: KĐM X mã hóa tổng hợp protein HBx. Protein HBx có vai trò chuyển hóa (transactivation) trong quá trình sao chép của vi rut. Vì vậy, protein HBx có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư ở các tế bào gan bị nhiễm.

HBx có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho nhiều gen đích của tế bào, làm trung gian hay đối lập cho nhiều chức năng khác nhau của tế bào như điều hòa chu trình tế bào, mã hóa tổng hợp các phân tử kết dính, hoạt hóa các gen sinh ung thư hoặc các gen ức chế ung thư của tế bào

1.2. Gen TP53 và đột biến gen TP53

1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen TP53

Gen TP53 có kích thước 22000 bp, gồm 11 exon mã hoá cho một RNA thông tin có kích thước 2.2 Kb. Quá trình dịch mã được bắt đầu từ exon 2. Gen TP53 đã được nghiên cứu hơn 30 năm qua, nó là một protein có trọng lượng phân tử khoảng 53 kDa, TP53 thường được tìm thấy với nồng độ cao trong các tế bào ung thư. Khoảng một thập kỷ đầu, TP53 được xem là một kháng nguyên ung thư với khả năng biến đổi mạnh. Mãi tới những năm cuối của thập kỷ 80 của thế kỷ trước người ta mới chứng minh được nó thực chất là một chất ức chế khối u. Gen TP53 mã hóa tổng hợp protein P53 có nhiều chức năng sinh học quan trọng: Điều hòa kiểm soát sự phát triển của tế bào, cảm ứng cho quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis), tham gia sửa chữa các thương tổn ADN bằng cách làm ngừng chu kỳ phân bào ở G1/S và G2/M, do đó các tế bào có thời gian sửa chữa thương tổn, các tế bào con sau khi phân bào sẽ bình thường như tế bào mẹ trước khi bị thương tổn. Do các chức năng trên nên gen TP53 được cho là gen ức chế quan trọng nhất trong hàng chục gen ức chế ung thư khác nhau. Gen TP53 đột biến có thể làm giảm tổng hợp protein P53 có chức năng sinh học bình thường. Như vậy, khi gen TP53 đột biến sẽ kích hoạt sự hình thành các khối u.

1.2.2. Mối liên quan giữa TP53 với HBV

HBx là một gen nhỏ nhất của HBV, nhưng có vai trò rất quan trọng trong sinh bệnh học nhiễm HBV, đặc biệt là trong cơ chế gây ung thư gan. Nhiều nghiên cứu cho thấy gen HBx có khả năng liên kết với TP53 dẫn đến làm mất chức năng của TP53, gây rối loạn chết có chương trình và mất kiểm soát tăng sinh tế bào, cuối cùng là hình thành các khối u.

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Gồm 263 bệnh nhân chia thành 5 nhóm (5 thể bệnh) và 1 nhóm chứng

+ Nhóm 1 (NMVR): 53 người mang vi rut viêm gan B mạn tính không triệu chứng.

+ Nhóm 2 (VGC): 31 bệnh nhân viêm gan B cấp tính

+ Nhóm 3 (VGM): 53 bệnh nhân viêm gan B mạn tính

+ Nhóm 4 (XG): 32 bệnh nhân xơ gan có HBsAg (+)

+ Nhóm 5 (UTG): 94 bệnh nhân UTG có HBsAg (+)

+ Nhóm chứng: 100 người khỏe mạnh

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn: Theo Dienstag J.L, (Harrison's 2007)

+ Lâm sàng khởi phát từ từ và diễn biến thành 2 giai đoạn rõ rệt là giai đoạn tiền hoàng đản và giai đoạn hoàng đản.

+ Tiền sử: - Chưa có vàng da, vàng mắt trước khi mắc bệnh

+ Xét nghiệm: - HBsAg (+), Anti HBc IgM (+) và Anti HBc IgG (-)

- Enzyme gan (AST, ALT) tăng cao, từ 400 - 4000UI/ml hoặc hơn.

2.1.1.2 Viêm gan B mạn tính

+ LS: Bệnh nhân mệt mỏi, đau vùng gan…

+ HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và anti HBcIgG(+)

+ HBV – DNA huyết thanh ≥ 10⁵ copies/ml ở nhóm HBeAg(+) hoặc HBV – DNA ≥ 10⁴ copies/ml ở nhóm HBeAg (-)

+ Enzyme gan (AST, ALT) tăng liên tục hoặc từng đợt, ít nhất ≥ 2 lần giá trị bình thường, có thể từ 100 - 1000UI/ml.

+ Mô bệnh học: có hình ảnh viêm gan mạn hoạt động

Bệnh nhân xơ gan có đầy đủ hội chứng:

+ Hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa:

+ Hội chứng suy chức năng gan:

+ Thay đổi ở gan: gan to chắc hoặc gan teo…

+ Xét nghiệm: HBsAg (+), Enzyme gan (AST, ALT) tăng nhẹ ít khi đến 300UI/ml, Protein máu giảm, Albumin giảm, A/G <1, tỷ lệ Prothrombin giảm,

+ Lâm sàng: Mệt mỏi ăn uống kém, gầy sút cân nhanh...

+ Xét nghiệm: Xét nghiệm huyết thanh học HBsAg (+), AFP tăng cao, Bilirubin trực tiếp và gián tiếp có thể tăng, Enzyme gan (AST, ALT) hoặc phosphataza kiềm tăng.

+ Siêu âm gan có khối khu trú hoặc tổn thương lan toả.

+ Chụp CT Scanner hoặc MRI xác định được vị trí, kích thước của khối u.

+ Tế bào bệnh học: xác định có UTG và mức độ biệt hóa kèm theo.

+ Lâm sàng: Hoàn toàn khoẻ mạnh, không có bất kỳ các triệu chứng lâm sàng nào, tình cờ phát hiện có HBsAg (+), tiền sử chưa bị viêm gan

+ Các xét nghiệm về chức năng gan trong giới hạn bình thường.

2.1.1.6. Nhóm chứng: Hoàn toàn khỏe mạnh không có triệu chứng viêm gan, không mắc bệnh mạn tính. Xét nghiệm HBsAg(-), Anti HCV(-), Anti HIV (-), tiền sử chưa bị viêm gan.

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

+ Trẻ em và phụ nữ có thai

+ Bệnh nhân có anti HIV (+), anti HCV (+).

+ Bênh nhân đã được điều trị bằng các thuốc kháng vi rut và các thuốc điều biến miễn dịch, người nghiện rượu và ma túy.

+ Bệnh kết hợp: Viêm gan do thuốc, do hóa chất, viêm gan tự miễn, Đái tháo đường, viêm đường mật…

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

- Khám lâm sàng và xét nghiệm chọn các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn của các nhóm nghiên cứu

2.2.2.Phương pháp nghiên cứu lâm sàng

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu cận lâm sàng

• 
  Xét nghiệm sinh học phân tử: Thực hiện tại khoa Sinh học phân tử Bệnh viện TƯQĐ 108:
  

+ Xác định đột biến gen TP53:

1. 
   PCR – RFLP: Dùng Enzyme Hae III
   
2. 
   Giải trình tự gen trên hệ thống phân tích trình tự tự động CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ).
   

+ Phương pháp định lượng nồng độ protein P53:

Protein P53 được định lượng bằng bộ Kit ELISA (P53 Human ELISA Kit) của hãng Abcam. Mã code ELISA: AB 46067, ngưỡng phát hiện ≥ 1,5U/ml.

+ Xác định đột biến gen HBx:

Giải trình tự gen trên hệ thống phân tích trình tự tự động CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ).

Trình tự mồi được sử dụng giải trình tự gen HBx là:

HBV-1369 F: 5’-TTTCCATGGCTGCTAGGCTGTACT-3’

HBV-1961 R: 5’-AAGGCAAAAACGAGAGTAACTCC-3'

• 
  Xét nghiệm miễn dịch: Tại khoa miễn dịch
  
• 
  Xét nghiệm huyết học: Tại khoa huyết học
  
• 
  Xét nghiệm sinh hóa: Tại khoa sinh hóa
  
• 
  Siêu âm gan, CT Scanner gan, MRI: Tại khoa chẩn đoán hình ảnh
  
• 
  Mô bệnh học: Tại khoa giải phẫu bệnh
  

2.2.4. Nội dung nghiên cứu

2.3. Xử lý thống kê- Các số liệu được phân tích bằng thuật toán non - parametric Mann - Whitney U-test, khi bình phương (χ² test), so sánh không đối xứng T-test, so sánh 2 tỷ lệ, 2 số trung bình, tỷ suất chênh (OR), mối tương quan (RR) bằng các phần mềm Statview version 4.5, chương trình STATA.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu

3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới

Chỉ số Nhóm	Nam (n,%)	Nữ (n,%)	Tuổi (năm)
NMVR (n=53) (1)	37(69,8)	16(30,2)	29,6±11,1
VGC (n=31) (2)	23(74,2)	8(25,8)	27,5±8,3
VGM (n=53) (3)	45(84,9)	8(15,1)	41,8±12,3
XG (n=32) (4)	24(75)	8(25)	54,5±14,6
UTG (n=94) (5)	83(88,3)	11(11,7)	55,1±13
Tổng (n =263)	212 (80,6)	51 (19,4)
p	P1-5<0,05		4,5-1,2,3<0,05

3.1.2. Đặc điểm một số triệu chứng lâm sàng của các nhóm nghiên cứu

Có 7 bệnh nhân VGM (13,2%) và 3 bệnh nhân UTG (3,19%) không có triệu chứng lâm sàng, tình cờ phát hiện khi kiểm tra sức khỏe.

3.1.3. Đặc điểm một số xét nghiệm cận lâm sàng của các nhóm nghiên cứu

Chỉ số Nhóm	HBeAg(+) (n,%)	HBeAg(-) (n,%)	TC (G/L)	Tỉ lệ Prothrombin
NMVR (n=53) (1)	28(52,8)	25(47,2)	293,7 ± 63	93,5 ± 9,7
VGC (n=31) (2)	18(58)	13(42)	167,5 ± 35	92 ± 7,7
VGM (n=53) (3)	31(58,5)	22(41,5)	212,7 ± 73	91,5 ± 12,5
XG (n=32) (4)	16(50)	16(50)	121,4 ± 15	78,4 ± 20,2
UTG (n=94) (5)	54(57,4)	40(42,6)	188,1 ± 97	86,7 ± 15,5
p	> 0,05		4-1,2,3,5<0,01	4-1,2,3,5<0,05

Chỉ số Nhóm	AST (U/L)	ALT (U/L)	Bilirubin TP (µMol/L)
NMVR (n=53) (1)	27,7±5,8	29 ± 5,8	9,8 ± 0,9
VGC (n=31) (2)	829,4± 344,7	1046±488,6	82,2±105,2
VGM (n=53) (3)	355± 472	412,5±530,8	60,8±102,4
XG (n=32) (4)	193,4±254,6	133,13±178	144,3±190,8
UTG (n=94) (5)	116±140,7	86,8±78	35,4 ±15,1
p	1-2,3,4,5<0,001 2-3,4,5<0,001 4-5<0,05	1-2,3,4,5<0,001 2-3,4,5<0,001 4-5<0,05	1-2,3,4<0,01 4-2,3,5<0,01

Chỉ số Nhóm	Protein TP (g/L)	Albumin (g/L)	AFP(ng/ml)
NMVR (n=53) (1)	74,6 ± 4	39,4 ± 2,9
VGC (n=31) (2)	72,5 ± 5,9	38,3 ± 2,1	15,6 ± 22,5
VGM (n=53) (3)	74,7 ± 5,2	38,2 ± 3,5	10,5 ± 13,3
XG (n=32) (4)	66,2 ± 5,4	33,1 ± 2,2	16,6 ± 22,3
UTG (n=94) (5)	75,7 ± 5,5	36,7 ± 4,4	131,2 ± 132,7
p	4-1,2,3,5<0,01	4-1,2,3,5<0,05	5-2,3,4 < 0,05

Chỉ số Nhóm NC	HBV DNA (copies/ml)		p
NMVR (1)	107 x 107	380 x 107	p1-5<0,05
VGC (2)	72 x 107	99 x 107	p2-5<0,0001 p2-4<0,001
VGM (3)	83 x 107	150 x 107	p3-5<0,01
XG (4)	2,8 x 107	2,5 x 107	p4-5<0,05
UTG (5)	14 x 107	29 x 107

3.2. Đột biến gen TP53 và mối liên quan với biểu hiện bệnh nhiễm HBV

3.2.1. Kết quả xác định đột biến gen TP53 tại vị trí 249^ser bằng PCR RFLP.

Ghi chú: băng 1,3 là mẫu không đột biến bị cắt và cho sản phẩm là 2 đoạn băng có kích thước 66 và 92 bp; băng 2 là mẫu đột biến gen dị hợp tử, sau khi cắt enzyme cho 3 sản phẩm có kích thước 66, 92 và 158 bp; băng 4 là mẫu không cắt enzyme, có kích thước 158 bp; M là thang chuẩn.

3.2.2. Kết quả xác định đột biến gen TP53 tại vị trí 249^ser bằng giải trình tự gen

Từ trình tự nucleotide chúng tôi tiến hành phân tích trên phần mềm BioEdit để so sánh trình tự axit amin giữa mẫu bình thường và mẫu đột biến gen. Kết quả cho thấy tại vị trí 249 của gen TP53 trên mẫu bình thường có axit amin là Arginine, trong khi đó tại mẫu đột biến được thay thế bằng axit amin Serine. Do đó, người ta ký hiệu điểm đột biến này là 249 Ser (Hình 3.3).

3.2.3. So sánh tỷ lệ đột biến gen TP53 trên các nhóm nghiên cứu

3.2.4. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với UTG

Gen TP53 Chỉ số HH	TP53 đột biến (n=12)	TP53 bình thường (n=82)	p
SL tiểu cầu (G/L)	204,5±158,2	185,8±87,1	>0,05
Prothrombin (%)	90,5±13,8	86,1±15,8	>0,05

3.2.6. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với một số chỉ số sinh hóa

Gen TP53 Chỉ số SH	TP53 đột biến (n=12)	TP53 bình thường (n=82)	p
AST (U/L)	135±259,3	112,9±112,7	>0,05
ALT (U/L)	51,8±26,3	92,5±82,3	>0,05
Bilirubin TP (µmol/L)	19,7±13,8	22,7±14,1	>0,05
Protein (G/L)	76,2±6,1	75,7±5,5	>0,05
Albumin (%)	37,9±4,8	36,5±4,3	>0,05

3.2.7. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với AFP và HBV DNA

Gen TP53 Chỉ số SH	TP53 đột biến (n=12)	TP53 bình thường (n=82)	p
AFP (ng/ml)	144,1±150,5	129±130,5	>0,05
HBV DNA (copies/ml)	9,5.107±2,6.107	1,4.108±3.107	>0,05

3.2.8. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với mức độ biệt hóa tế bào gan

3.2.9. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với đột biến gen HBx tại 2 vị trí A1762T và G1764A

Ngoài ra, không có mối liên quan nào được ghi nhận giữa đột biến gen TP53 với các chỉ số khác như tuổi, giới...

3.3. Protein P53 trong huyết tương

3.3.1. So sánh tỷ lệ bệnh nhân định lượng được nồng độ protein P53 trong huyết tương

3.3.2. So sánh nồng độ protein P53 trong huyết tương ở các nhóm nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu	Protein P53 (U/ml)	p
Chứng (n=50) (1)	41,6 ± 47,9	1-4<0,01
NMVR (n=50) (2)	37,1 ± 37,8	2-4<0,01
VGC (n=30) (3)	9,56 ± 4,03	3-1, 2, 5 < 0,01
VGM (n=50) (4)	13,5 ± 14,9	4-5<0,05
XG (n=30) (5)	44,7 ± 55,7	5-6<0,001
UTG (n=94) (6)	11,9 ± 11,1	1-6<0,0001 2-6<0,0001

3.3.3. So sánh nồng độ protein P53 ở nhóm có gen TP53 đột biến và gen TP53 bình thường

Gen TP53 Protein	Đột biến (n = 18)	Bình thường (n = 310)	p
Protein P53 (U/ml)	6,7 ± 2,6	28,5 ± 37,7	<0,05

Chương 4

BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm chung của các nhóm nghiên cứu

4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới

Kết quả cho thấy chủ yếu là bệnh nhân nam chiếm 80,6%, nữ chiếm 19,4% (bảng 3.1) tương đối phù hợp với các tác giả khác.

Riêng nhóm ung thu gan tỉ lệ nam (88,3%) nữ (11,7%) cao hơn hẳn nhóm NMVR, nam (69,8%) sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Có thể cùng nhiễm và mang HBV, nhưng nam giới nguy cơ UTG cao hơn nữ.

Về tuổi: trẻ nhất là nhóm VGC, cao tuổi nhất là nhóm UTG, XG (bảng 3.1).

4.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm của các nhóm nghiên cứu.

Vì chúng tôi chọn bệnh nhân nghiên cứu theo tiêu chuẩn quốc tế điển hình, nên triệu chứng lâm sàng và các xét nghiệm sinh hóa, huyết học, miễn dịch là điển hình cho các nhóm, không có gì đặc biệt: AST, AST cao nhất ở VGC; protein toàn phần Albumin, tỉ lệ protein thấp nhất ở nhóm XG, Bilirubin toàn phần cao nhất ở nhóm XG, AFP cao nhất ở nhóm UTG.

HBV DNA cao nhất ở nhóm NMVR, thấp nhất ở nhóm UTG, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05) (Bảng 3.6)

4.2. Đột biến gen TP53 và mối liên quan với biểu hiện bệnh nhiễm HBV:

4.2.1. Tần suất xuất hiện đột biến gen TP53 trên các nhóm nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy: Tổng số có 18/328 mẫu (5,48%) có đột biến gen TP53. Tỉ lệ chung và ở các nhóm chứng, NMVR, VGM, XG (6,7% ) tương đối thấp, nhưng ở nhóm UTG (12,7%) cao hơn hẳn, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm UTG với các nhóm còn lại (p < 0,05)

So sánh với tác giả Lê Thị Thúy và cộng sự, thấy tỉ lệ đột biến gen TP53 trên UTG là 11,7%, khá phù hợp với kết quả của chúng tôi.

Còn so sánh với nghiên cứu ở Gambia, nơi mà tỉ lệ nhiễm và mang HBV cao (11 - 16%) tương tự ở Việt Nam, Kirk và cộng sự thấy tỉ lệ đột biến gen TP53 ở XG là 15%, UTG 45%; kết quả tỉ lệ đột biến gen TP53 ở Gambia cao hơn hẳn của chúng tôi, có thể liên quan đến yếu tố địa lý môi trường, chủng tộc.

4.2.2. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với ung thư gan.

Trong nghiên cứu này, tỉ lệ đột biến gen TP53 ở nhóm không UT tương đối thấp (2,56%) còn tỉ lệ đột biến gen TP53 ỏ nhóm UTG cao hơn hẳn (12,7%)

Qua các thuật toán thống kê so sánh, chúng tôi thấy nguy cơ UTG ở bệnh nhân mang gen TP53 đột biến cao hơn bệnh nhân mang gen TP53 không đột biến là 5,5 lần (p < 0,001)

4.2.3. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với các chỉ số sinh hóa, huyết học ...

Do tỉ lệ bệnh nhân mang gen TP53 đột biến ở các nhóm NMVR, VGM, XG thấp, nên chúng tôi chỉ tiến hành phân tích mối liên quan của đột biến gen TP53 với các chỉ số sinh hóa, huyết học, miễn dịch... trên nhóm UTG.

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số: sinh hóa, huyết học, HBV - DNA, AFP...giữa các bệnh nhân có đột biến gen TP53 và không đột biến gen TP53 ở nhóm UTG. Có thể các bệnh nhân này đều là UTG nên các biến động về các chỉ số là tương đương nhau.

Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy không có mối liên quan giữa đột biến gen TP53 mức độ biệt hóa tế bào gan trên nhóm UTG.

4.2.4. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với đột biến gen HBx tại hai vị trí A 1762 T và G1764 A.

Như phần tổng quan đã trình bày: HBx là đoạn gen nhỏ nhất của HBV, nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm và bệnh sinh UTG. Hơn nữa gen HBx có đoạn liên kết với gen TP53 của người bệnh. Trong nghiên cứu chung của chúng tôi có một nghiên cứu về đột biến gen HBx, kết quả cho thấy trên 60% bệnh nhân UTG có đột biến gen HBx ở 2 vị trí A1762T và G1764A. Đột biến gen HBx còn liên quan đến mức độ biệt hóa tế bào trên các bệnh nhân UTG.

Qua nghiên cứu so sánh, chúng tôi thấy 100% bệnh nhân có đột biến gen TP53 đều có đột biến gen HBx.

Ngoài ra, không có mối liên quan nào được ghi nhận giữa đột biến gen TP53 với các chỉ số khác như tuổi, giới...

4.3. Protein P53 trong huyết tương.

4.3.1. So sánh tỉ lệ bệnh nhân định lượng được nồng độ protein P53 trong huyết tương.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Kit Elisa của hãng Abcam để định lượng nồng độ protein P53 không đột biến ở các nhóm nghiên cứu ngưỡng phát hiện là ≥ 1,5 UI/ml, kết quả cho thấy có 43,5% mẫu định lượng được protein P53 trong huyết tương. Tỉ lệ định lượng được protein P53 trong huyết tương giảm dần từ nhóm chứng đến XG, NMVR, VGM, cuối cùng là nhóm UTG và VGC.

So sánh với tác giả Charuruk (2001), tỷ lệ bệnh nhân định lượng được protein P53 trong huyết tương chỉ là 22,7%; thấp hơn hẳn so với chúng tôi. Có thể sự khác biệt này là do đối tượng khác nhau và bộ kit ELISA hiện nay nhạy hơn 10 năm trước.

4.3.2. So sánh nồng độ protein P53 trong huyết tương ở các nhóm nghiên cứu.

Tương tự như tỉ lệ % bệnh nhân định lượng được protein P53 thì nồng độ protein p53 cũng thấp nhất ở nhóm UTG và VGC. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,0001).

Như trên đã đề cập, do P53 là một protein có tác dụng ức chế khối u phát triển nên thông thường trên các đối tượng khỏe mạnh nồng độ protein này sẽ cao hơn so với nhóm bệnh ung thư. Ngược lại, nồng độ P53 đột biến lại cao hơn ở bệnh nhân ung thư so với người khỏe mạnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit của hãng Abcam để định lượng nồng độ P53 không đột biến. Kết quả cho thấy trên nhóm chứng và nhóm NMVR nồng độ P53 cao hơn có ý nghĩa so với VGC và VGM. Đặc biệt là trong nghiên cứu này nồng độ P53 ở bệnh nhân VGM lại cao hơn VGC. Phải chăng có sự tác động qua lại giữa các gen của HBV và gen người trong quá trình viêm gan mạn tính

Như trên đã trình bày, protein P53 có thể liên kết với protein HBx để tạo thành phức hợp protein-protein. Kết quả dẫn đến làm bất hoạt hóa chức năng hoạt hóa dịch mã của protein này. Phân tích trình tự gen P53 thể hoang dại cho thấy nó có thể liên kết với chuỗi trình tự TGCCTTGCCT của bất kỳ DNA nào. Khi liên kết này được thực hiện thì nó sẽ loại bỏ chức năng hoạt hóa của gen kiểm soát phát triển đặc hiệu. Chính HBV có một đoạn trình tự gen của HBx có thể liên kết với P53 qua đoạn gen này

4.3.3. So sánh nồng độ protein P53 ở nhóm có gen TP53 đột biến và gen TP53 bình thường.

Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhóm bệnh nhân có gen P53 đột biến tại điểm 249^ser nồng độ protein P53 thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân có gen P53 bình thường (6,7 ± 2,6 so với 28,5 ± 37,7 U/ml (p < 0,05).

Đây chỉ là kết quả bước đầu chúng tôi ghi nhận ở nghiên cứu này. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của đột biến gen TP53 tới nồng độ protein P53 còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nữa, ở đây chúng tôi chỉ nghiên cứu đột biến gen TP53 tại điểm 249^ser.

Ngoài ra, không có mối liên quan nào giữa nồng độ protein P53 với các chỉ số sinh hóa, huyết học, miễn dịch... ở các nhóm nghiên cứu.

KẾT LUẬN

- Tổng số có 18/328 (5,48%) mẫu mang gen TP53 đột biến tại vị trí 249^ser. Tỷ lệ đột biến gen TP53 ở các nhóm tương ứng là: chứng (3%), NMVR (0%), VGM (1,8%), XG (6,7%) và UTG (12,7%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm UTG với các nhóm còn lại (p<0,05).

- Bệnh nhân mang đột biến gen TP53 tại vị trí 249^ser có nguy cơ ung thư gan cao hơn so với bệnh nhân không mang gen đột biến (OR, KTC 95%) là 5,5 lần (1,8-18,5), (p<0,001).

2. Nồng độ protein P53 trong huyết tương khác nhau ở các thể bệnh do nhiễm HBV, thấp nhất ở nhóm UTG và VGC.

- Tỷ lệ bệnh nhân định lượng được protein P53 trong huyết tương giảm dần từ nhóm chứng (72%), XG (76,6%) đến NMVR (56%), VGM (45%), VGC (40%) và cuối cùng là nhóm UTG (11,7%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

- Nồng độ protein P53 thấp nhất ở nhóm UTG (11,9 ± 11,1 U/ml) và VGC (9,56 ± 4,03 U/ml), tiếp đến là các nhóm VGM (13,5 ± 14,9 U/ml), NMVR (37,1 ± 37,8 U/ml), chứng (41,6 ± 47,9 U/ml) và cao nhất ở nhóm XG (44,7 ± 55,7 U/ml). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

- Ở nhóm bệnh nhân có gen TP53 đột biến tại điểm 249^ser, nồng độ protein P53 thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân có gen TP53 bình thường (6,7 ± 2,6 so với 28,5 ± 37,7 U/ml, p<0,05).

KIẾN NGHỊ