Các phương pháp tổng hợp atenolol

1.2. Các phương pháp tổng hợp atenolol

Phương pháp này ít có ý nghĩa về mặt thực tiễn do điều kiện phản ứng khá ngặt nghèo, cần nhiệt độ và áp suất cao. Hơn thế nữa giai đoạn một của phản ứng (Willgerodt) không chọn lọc, thường tạo ra hỗn hợp gồm axít p-hydroxiphenylaxetic và p-hydroxiphenylaxetamit. Nên ít được sử dụng trong thực tế.

Phương pháp này được giới thiệu để tổng hợp atenolol dưới dạng raxemic hoặc dạng tinh khiết của các đồng phân R và S của atenolol (khi sử dụng enzim) [16, 17, 25, 26, 27, 28, 29].

Từ sản phẩm (3) này có thể điều chế atenolol theo 3 cách như sau:

Mặc dù cả 2 dạng atenolol đều có hoạt tính sinh học, tuy nhiên những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng (S)-atenolol ít gây phản ứng phụ hơn dạng hỗn hợp raxemic, như trong phần tổng quan đã đưa ra. Các bước sau đây sẽ mô tả chi tiết về cách điều chế các dạng đối quang của atenolol từ 1-[p-[(butoxi-cacbonyl)metyl]phenoxi]-3-clopropan-2-ol (3) sử dụng xúc tác enzym Lipase Catalysis.

Dạng S-isomer (4) sau đó sẽ được tiến hành các bước điều chế tương tự như điều chế hỗn hợp raxemic của atenolol như đã nêu ở bước 3.1. Sản phẩm thu được là dạng (S)-atenolol.

Dạng (R+)isomer (5) sau đó cũng được cho phản ứng với isopropyl amin sau đó thuỷ phân bằng NH₃ trong metanol để thu được sản phẩm cuối cùng là (R)+atenolol.

Các phương pháp sử dụng enzim cho một giai đoạn trong quá trình tổng hợp atenolol có ưu điểm là có thể tạo ra các đồng phân sạch (S)- hoặc (R)+atenolol theo như ý muốn tuỳ thuộc vào enzim sử dụng. Tuy vậy phương pháp này ít được đưa vào thực tế do phải sử dụng enzim và điều kiện tiến hành phản ứng khó có thể triển khai ở quy mô lớn.

Từ phenol, thực hiện phản ứng clometyl hóa để tạo dẫn xuất p-clometylphenol. Sau đó chuyển hóa tiếp với natri xianua trong dung môi dimetyl focmamit để tạo ra sản phẩm là p-hydroxiphenylaxetonitrin, tiếp đó thủy phân sản phẩm này bằng xúc tác khác nhau sẽ thu được p-hydroxiphenylaxetamit, chuyển hóa tiếp với epiclohydrin để tạo hỗn hợp 2 dạng epoxi và halohydrin của p-hydroxiphenylaxetamit. Cuối cùng hóa hợp với lượng dư isopropylamin để tạo ra hỗn hợp raxemic của atenolol [13, 18, 19, 35]

Có thể điều chế atenolol thông qua dẫn xuất nitrin bằng 2 cách [20]:

Thứ nhất: phản ứng của phenol (I) với focmandehit để tạo thành 4-hydroximetylphenol (II), sau đó cho (II) phản ứng tiếp với NaCN trong dung môi dimetylfocmamit (DMF) nóng để tạo thành 2-(4-hydroxiphenyl)axetonitrin (III). Thuỷ phân sản phẩm (III) bằng cách đun hồi lưu trong hỗn hợp etanol/nước, với xúc tác Pt sẽ thu được dẫn xuất axetamit (IV). Sau đó cho (IV) ngưng tụ với lượng dư epiclohydrin (V) nóng trong piperidin sẽ tạo thành 2-[4-(2-oxiranylmetoxi)phenyl]axetamit (VI). Cuối cùng thực hiện phản ứng mở vòng oxiran (VI) với isopropylamin trong metanol để thu được atenolol.

Thứ hai: 2 bước đầu tương tự như trên, tiếp theo ngưng tụ sản phẩm dẫn xuất axetonitrin (III) với epiclohydrin (V) để tạo thành 2-[4-(2-oxiranylmetoxi)phenyl]axetonitrin (VIII), sau đó cho phản ứng tiếp với isopropylamin (VII) trong metanol để tạo thành 2-[4-[2-hydroxi-3-(isopropylamin)propoxi]phenyl]axetonitrin (IX). Cuối cùng thuỷ phân sản phẩm (IX) này bằng cách đun hồi lưu trong hỗn hợp dung môi etanol/nước, xúc tác Pt để thu được atenolol.

Trước hết, phenol được chuyển hóa thành các dẫn xuất p-hydroximandelic (hoặc muối natri) sau đó khử hóa với các tác nhân khác nhau [9, 10, 21, 22, 23] và cuối cùng chuyển hóa thành p-hydroxiphenylaxetamit trước khi cho phản ứng với epiclohydrin và isopropylamin. Sơ đồ để tổng hợp atenolol từ phenol như sau:

Phương pháp này đi từ các hoá chất thông dụng rẻ tiền, điều kiện phản ứng cũng không quá ngặt nghèo nên có thể tiến hành ở quy mô lớn.

So với phương pháp tổng hợp atenolol thông qua dẫ xuất nitrin ở mục 1.2.3.1 và 1.2.3.2, phương pháp được các tác giả đưa ra dưới đây không thuỷ phân ngay dẫn xuất nitrin để tạo thành amit mà quá trình thuỷ phân này chỉ được thực hiện ở giai đoạn cuối cùng của quá trình điều chế atenolol.

Từ hợp chất ban đầu 4-hydroxibenzylancol, sau đó được nitrin hoá bằng muối xianua kim loại kiềm với xúc tác là alkylfocmat. Sản phẩm tạo thành 4-hydroxiphenylaxetonitrin sau đó cho phản ứng với epiclohydrin trong môi trường kiềm (hoặc xúc tác chuyển pha), sản phẩm thu được là một hỗn hợp dạng epoxi hoặc halohydrin. Hỗn hợp này được cho phản ứng với isopropylamin để tạo thành dẫn xuất nitrin của atenolol. Thuỷ phân dẫn xuất này trong HCl sẽ thu được atenolol.

Phương pháp này tương tự như phương pháp tổng hợp từ 4-hydroxibenzylancol đã nêu ở trên, trong đó 4-hydroxibenzylancol sẽ được điều chế ‘tại chỗ’ bởi phản ứng khử 4-hydroxibenzandehit với tác nhân là một muối bo tetrahidrua của kim loại kiềm.

Phương pháp này sử dụng để tổng hợp dạng đồng phân tinh khiết (S)-atenolol.

Đầu tiên ngưng tụ axetamit (I) với (R)-epiclohydrin (II) trong dung dịch NaOH (hoặc LiOH; NaOH/benzyltrimetylamoni clorua (BTA-Cl) để tạo thành hỗn hợp gồm 2 dạng dẫn xuất là epoxipropan (III) và clopropanol (IV). Từ đó có thể điều chế trực tiếp thành (S)-atenolol bằng phản ứng trực tiếp với isopropylamin (V) trong metanol. Hoặc là trước hết cho hỗn hợp gồm (III)/(IV) phản ứng với NaOH để tạo thành (S)-(III) và sau đó cho phản ứng với isopropylamin (V) như trên để tạo thành sản phẩm mong muốn.

Sau khi tham khảo các con đường tổng hợp atenolol, chúng tôi lựa chon con đường khả thi nhất cho mục đích tổng hợp chất này phù hợp với điều kiện ở Việt Nam và có thể đưa ra sản xuất ở qui mô lớn: Đó là tổng hợp bằng con đường hóa học từ chất đầu phenol thông qua hợp chất trung gian chìa khóa p-hydroxyphenylaxetamit và sơ đồ của qui trình tổng hợp atenolol như sau :

SƠ ĐỒ TỔNG HỢP ATENOLOL

• 
  Máy khuấy từ gia nhiệt Heidolph MR Hei-Standard của Đức
  
• 
  Máy cất quay chân không IKA RV 06.2 của Đức, bơm chân không Buchi Vac V-500 của Thụy Sỹ
  
• 
  Bếp đun bình cầu Trung Quốc
  
• 
  Dụng cụ thuỷ tinh: Bình cầu 3 cổ các loại; sinh hàn; cột vigrơ; phễu nhỏ giọt; phễu chiết các loại; ống đong; cốc các loại; pipét...
  
• 
  Bản nóng hồng ngoại Schott SLK 2 của Đức
  
• 
  Cân điện tử 10^-3 Ohaus Explorer Pro EP613C (610 gam/1 mg)
  
• 
  Cân kỹ thuật 10^-2 Ohaus Explorer Pro EP4102C (4100 gam/0.01g)
  
• 
  Tủ hút khí độc Việt Nam
  

2.1.2. Các phương pháp sử dụng trong tổng hợp và tinh chế sản phẩm.

* Sắc ký bản mỏng (SKBM) được thực hiện trên các tấm bản mỏng đế nhôm tráng silicagen 60 F₂₅₄ của hãng Merck – Đức. Hiện màu bằng đèn soi UV Camag Viewing Box 3 ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc bằng bình phun thuốc thử H₂SO₄ 10% và đốt nóng ở 100⁰C.

* Sắc ký cột sử dụng silicagel có cỡ hạt 0,040–0,063 mm của hãng Merck – Đức.

2.1.3. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc của các sản phẩm.

Phổ tử ngoại khả kiến được đo trên máy GBC cintra 40 UV-VIS Spectrophotometer của Đức tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chế độ đo: đo độ hấp thụ Abs, máy đo hai chùm tia, dải bước sóng 200-600 nm, độ rộng khe phổ 1,0 nm, tốc độ quét 600 nm/phút, dung môi metanol.

Phổ IR của các chất được đo SHIMADZU FTIR 8107M của Nhật tại viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên - viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chế độ đo: đo độ truyền qua, dải số sóng 4000-500 cm^-1, độ phân giải 0,25 cm^-1, số lần quét 32 lần/phổ; mẫu được chuẩn bị bằng cách nghiền mịn với bột KBr theo tỷ lệ 5  10 mg chất / 1gam KBr và ép thành viên trong suốt ở 600 psi trong 5 phút.

Phân tích Sắc ký lỏng - khối phổ HPLC/DAD/MS trên máy Agilent HPLC 1200 series / Agilent 6310 Ion Trap của Mỹ tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Điều kiện phân tích:

• 
  Sắc ký lỏng (HPLC): cột không phân cực pha đảo HPLC Zorbax C₁₈ đường kính 3.0 mm x dài 150mm, kích thước hạt nhồi 5µm, dung môi MeOH: H₂O 0,1% axit fomic, tốc độ dòng 0,5 - 0,8ml/phút, detector DAD
  
• 
  Khối phổ MS: nguồn ion hoá sử dụng chế độ ion hoá phun điện ESI⁺/ESI^- (Electrospray ionization) với khí N₂ là khí phun bụi ở áp suất phun 40 psi và nhiệt độ khí 380⁰C, bộ tách khối sử dụng kiểu bẫy ion (iontrap).
  

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT được đo trên máy Bruker Advance - 500 của Đức tại Phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các điều kiện đo: tần số 500 MHz và 125MHz, dung môi DMSO-d₆, chất chuẩn nội TMS.

Cho vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 2000 ml đã được lắp máy khuấy, phễu nhỏ giọt và sinh hàn hồi lưu 225,6g (213 ml, 2,4 mol) phenol, 199,8g (150 ml, 1,35 mol) dung dịch axit glyoxylic 50% trong nước, rồi thêm 600ml H­₂O. Làm lạnh hỗn hợp bằng đá muối bên ngoài sao cho nhiệt độ của hỗn hợp ở khoảng 10-15⁰C. Từ phễu nhỏ giọt, vừa khuấy hỗn hợp phản ứng, vừa nhỏ giọt dung dịch NaOH 50% (khoảng 130 ml) vào trong hỗn hợp và luôn duy trì nhiệt độ của phản ứng ở 10-15⁰C trong suốt quá trình nhỏ giọt. Quá trình thêm dung dịch NaOH 50% chỉ kết thúc khi pH của hỗn hợp phản ứng đạt 10,5-11. Nâng nhiệt độ của phản ứng lên 35⁰C và duy trì phản ứng ở nhiệt độ này trong 3 giờ. Điều chỉnh pH của phản ứng về đến 7 bằng axit HCl đặc và chiết ở 35⁰C với benzen (1lần x 300 ml) và metylbutylxeton (2 lần x 300 ml) để loại hết phenol dư không phản ứng hết. Tiếp tục axit hoá bằng HCl đến pH = 2 và chiết 5 lần với etyl axetat (mỗi lần 300 ml). Hoá hợp các dịch chiết lại với nhau, cất loại dung môi thu được 150g axit p-hyđroxymadelic (hiệu suất 65%).

Qui trình này liên quan đến quá trình khử hóa axit p-hyđroxymanelic monohydrat bằng SnCl₂. 2H₂O thành axit p-hyđroxyphenylaxetic (không phải từ muối natri của nó).

Cho vào trong bình cầu đáy tròn dung tích 50ml được đặt trên máy khuấy từ 8ml HCl đặc, 8 ml nước và 7,0g axit axit p-hyđroxymanelic monohydrat. Hỗn hợp này được khuấy kĩ, sau đó cho tiếp 9g SnCl₂.2H₂O vào hỗn hợp phản ứng. Đặt hỗn hợp phản ứng trong nồi cách thuỷ trên bếp từ và đun sôi nồi cách thuỷ khoảng 1 giờ. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm lạch đến 10⁰C, kết tủa trắng được lọc, rửa nhanh với axeton và sấy khô ở 50⁰C trong chân không.

2.2.3. Tổng hợp p-hydroxyphenylaxetamit

22,8g (0,15mol) Axit p-hyđroxyphenylaxetic được hoà tan trong 45ml isobutylmetylxeton trong bình cầu đáy tròn đặt trên bếp từ và được đun nóng đến nhiệt độ bay hơi 105⁰C ở áp suất khí quyển, khi hỗn hợp đẳng phí của nước và isobutylmetylxeton được cất loại ra, dung dịch được làm lạnh đến 10⁰C và 30ml metanol và một vài giọt HCl đặc (37%, d=1,18g/ml) được thêm vào. Hỗn hợp phản ứng được hồi lưu 4 tiếng và dung môi được cất loại dưới áp suất giảm (50mmHg) ở nhiệt độ bên trong 100_­⁰C. Phần còn lại được làm lạnh đến 10⁰C và 51ml dung dịch amonihydroxit (1,5 mol, d = 0,880g/ml) được thêm vào và hỗn hợp được khuấy ở 20 – 25⁰C cho khoảng 10 – 12 giờ. Lượng NH­­₄OH dư được cất loại ở nhiệt độ bên trong 100⁰C, và phần còn lại được làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Hỗn hợp phản ứng được lọc và chất rắn thu được được rửa 2 lần với một ít nước lạnh và làm khô trong chân không ở 80⁰C. Sản phẩm thu được là p-hydroxyphenylaxetamit. Để thu được p-hydroxyphenylaxetamit sạch, sản phẩm được kết tinh lại từ nước có khối lượng 16,5g (hiệu suất 75%).

Hỗn hợp của p-hydroxyphenylaxetamit và epiclohydrin theo tỷ lệ 1:3 được khuấy trong bình cầu. Tiếp đó, cho vào hỗn hợp này một lượng nhỏ NaOH và nước. Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng khoảng 3-5 ngày và sau đó sản phẩm ở dạng chất rắn màu trắng được lọc, làm khô và kiểm tra khả năng chuyển hóa cũng như tỷ lệ của hai dạng sản phẩm là epoxi và halohydrin bằng máy sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS).

Hỗn hợp của p-hydroxyphenylaxetamit và epiclohydrin theo tỷ lệ 1:4 và một lượng nhỏ xúc tác chuyển pha trimetyl amoni clorua được đựng trong bình cầu đáy tròn đặt trên bếp khuấy từ. Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt lên đến 90⁰C và duy trì ở nhiệt độ này trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng, một lượng nhỏ nước được thêm vào để loại hết các hợp chất vô cơ. Lọc lấy sản phẩm màu trắng, làm khô đến khối lượng không đổi và xác định hiệu suất phản ứng và tỷ lệ giữa hai dạng epoxi và halohydrin.

Các hỗn hợp phản ứng gồm p-hydroxyphenylaxetamit, epiclohydrin và xúc tác chuyển pha trimetylamoni clorua với tỉ lệ như trên được thực hiện phản ứng ở các nhiệt độ 40, 50, 60, 70, 80 và 100⁰C và duy trì ở các nhiệt độ đó trong 1 giờ. Sản phẩm được lọc, làm khô và xác định hiệu suất phản ứng và tỷ lệ giữa hai dạng bằng máy sắc khí lỏng - khối phổ LC-MS.

Các hỗn hợp của p-hydroxyphenylaxetamit và epiclohydrin theo tỷ lệ 1:3 được cho vào trong bình cầu rồi thêm vào đó một lượng nhỏ hỗn hợp xúc tác bao gồm NaOH, trimetylamoni clorua và nước. Hỗn hợp này được khuấy ở các nhiệt độ từ 40-80⁰C trong 1,5 giờ. Kết thúc phản ứng, lọc chất rắn thu được, làm khô, xác định hiệu suất phản ứng và tỷ lệ giữa hai dạng epoxi và halohydrin.

Thêm 16 g hỗn hợp epoxi và halohydrin của p-hydroxyphenylaxetamit vào bình cầu đáy tròn dung tích 500ml có chứa 240ml isopropylamin, lắp sinh hàn hồi lưu hiệu lực và đặt bình cầu trên bếp từ. Vừa khuấy vừa đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 3 ngày. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và đuổi hết isopropylamin dư. Axit hoá dịch phản ứng thu được bằng 20ml dung dịch HCl 6N, khuấy kĩ và lọc dịch thu được trên phễu Busner, điều chỉnh pH của dịch lọc đến 10 bằng dung dịch NaOH 30%. Để yên qua đêm cho atenolol kết tinh. Lọc thu sản phẩm và tinh chế bằng cách kết tinh lại trong etylaxetat thu được 68g atenolol sạch.

6. 
   Tinh chế atenolol
   

Độc tính cấp và hoạt tính hạ huyết áp của atenolol được thực hiện ở Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Trường Đại học Y Hà Nội

1. 
   Nghiên cứu độc tính cấp của atenolol
   

Chuột nhắt trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 18 – 22g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.

Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 4 ngày trước khi nghiên cứu, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do.

Chuột được cân để xác định trọng lượng và được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con. Sau đó xác định LD₅₀ của atenolol trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon [3].

Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm.

Từng lô chuột nhắt được uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 3g/kg đến 21g/kg, uống 3 lần trong 24 giờ, mỗi lần uống cách nhau ít nhất 2h.

Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu và tính toán LD₅₀.

2. 
   Nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp của atenolol
   

Đối tượng: Gồm 75 con chuột cống trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 195 – 243g do Học viện Quân y cung cấp.

Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi nghiên cứu, được nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương sản xuất, uống nước tự do. Chuột được cân để xác định trọng lượng và được phân thành 5 lô ngẫu nhiên, mỗi lô 15 con.

Thiết bị:

+ Hốt khử mùi của hãng ESCO, Singapore

+ Máy đo huyết áp từ đuôi chuột (LE 5002 Storage pressure meter, Italy)

+ Và các thiết bị nhỏ lẻ khác (bộ đồ mổ, kim cong, chỉ...).

Hoá chất: Dung dịch nước muối sinh lý, cồn 90⁰ và ete, thuốc atenolol (vỉ 50mg của hãng STADApharm GmbH, Germany sản xuất).

Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của dược chất atenolol trên chuột cống trắng theo mô hình thắt động mạch thận. Đo huyết áp gián tiếp từ đuôi chuột cống trắng.

Dùng ete để gây mê chuột và phẫu thuật thắt động mạch thận trong hốt khử mùi. Đo huyết áp và nhịp tim trước 24 giờ và sau 6 - 7 ngày thắt động mạch thận.

Các lô nghiên cứu bao gồm:

Lô 1 (n = 15): uống nước bình thường (Lô đối chứng âm)

Lô 2 (n = 15): uống liều 56mg/kg trọng lượng/ngày

Lô 3 (n = 15): uống liều 84mg/kg trọng lượng/ngày

Lô 4 (n = 15): uống liều 112mg/kg trọng lượng/ngày

Lô 5 (n = 15): uống thuốc atenolol (viên 50mg/kg) 14mg/kg trọng lượng/ngày (Lô đối chứng dương)

Chuột được uống thuốc trong 3 ngày liên tiếp sau 7 ngày thắt động mạch thận. Mỗi ngày uống 1 liều duy nhất vào khoảng 7 – 8 giờ sáng. Đo huyết áp và nhịp tim sau uống thuốc 3 giờ và 7 giờ mỗi ngày.