Tế bào sừng (Keratinocyte)

Đã có một số nghiên cứu thử nghiệm ghép tế bào biểu bì đồng loại như Celaderm [17], [42]; tuy nhiên, hiệu quả và tính an toàn của các sản phẩm này phải được khẳng định bằng nghiên cứu lâm sàng có đối chứng. Các sản phẩm đồng loại có lợi ích là giảm chi phí sản xuất so với chi phí sản xuất sản phẩm tự thân. Hơn bao giờ hết, sự thiếu sót của cả hai sản phẩm là chúng khó bám và do đó dễ dẫn đến việc tạo thành nốt phồng [80].

Để điều trị bỏng sâu, cả lớp biểu bì và lớp trung bì của da cần được thay thế, việc điều trị bằng tấm tế bào biểu bì đơn thuần sẽ dẫn đến chất lượng liền vết thương thấp. Tương phản với tấm biểu bì nuôi cấy, các cấu trúc trung bì từ công nghệ có thể dự phòng co kéo vết thương và tạo ra tính bền vững cơ học tốt hơn. Vật liệu tương đương trung bì và biểu bì phải được ghép kế tiếp nhau việc làm cho tuần hoàn hóa trung bì tốt sau khi loại bỏ nền vết thương là cần thiết trước khi ghép lớp biểu bì [35]. Một số vật liệu này là mảnh ghép đồng loại đã được xử lý bằng hóa chất, ví dụ Alloderm không có thành phần tế bào gây ra đáp ứng miễn dịch thải ghép [77]. Ngược lại, Dermagraft lại có các nguyên bào sợi từ da bao quy đầu của người được nuôi cấy trên lưới polyglactin có khả năng giáng hóa [72]. Trong các vật liệu này, các tế bào tiết protein đệm gian bào, hàng loạt các yếu tố tăng trưởng và cytokin vào trong vết thương cho đến khi chúng trải qua quá trình tự hủy bình thường sau vài tuần ghép.

Purdue (1997) sử dụng tấm fibroblasts nuôi cấy là Dermagraft và so sánh với ghép da tử thi cho 66 bệnh nhân bỏng sâu được cắt hoại tử. Tác giả nhận thấy, tấm fibroblasts nuôi cấy có kết quả tốt tương đương với da tử thi trong việc hình thành mô hạt, kết quả về da ghép tự thân là tương đương, nhưng tấm fibroblasts dễ bóc khỏi mô hạt để ghép da tự thân nên không gây chảy máu như da tử thi. Tiếp tục theo dõi di chứng bỏng, tác giả nhận thấy vùng ghép fibroblasts có kết quả rất tốt về thẩm mỹ [61]. Hansbrough (1997) đã đánh giá khả năng của Dermagraft che phủ vết bỏng sau cắt hoại tử trên 10 vết thương có so sánh với da tử thi. Tác giả nhận thấy, khả năng bám dính, khả năng sống của Dermagraft là tương đương da tử thi, kết quả da ghép sống tương đương vùng ghép da tử thi. Không thấy có biểu hiện thải loại miễn dịch trong khi 4/10 vùng ghép da tử thi có biểu hiện thải loại lớp thượng bì [33].

1.3. Vai trò tế bào gốc trong liền vết thương

Mặc dù có nhiều tiến bộ đáng kể trong y tế và chăm sóc vết thương bằng các can thiệp ngoại khoa, việc điều trị các tổn khuyết da diện rộng và vết thương mạn tính vẫn còn là thách thức lớn với y học hiện nay. Trong liền vết thương, tế bào gốc trung mô được xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau [65]. Đã và đang có rất nhiều người quan tâm cả về khoa học nghiên cứu và lĩnh vực lâm sàng điều trị vết thương về tiềm năng và vai trò của các trị liệu tế bào dựa trên MSC trong việc kích thích tăng nhanh quá trình sửa chữa và tái tạo mô vết thương. Các nghiên cứu với MSC tủy xương đã cho thấy việc điều trị vết thương bằng tế bào MSC tủy xương đều làm tăng nhanh quá trình liền vết thương, tăng quá trình biểu mô hóa và tăng tạo mạch [26], [82]. Người ta thấy. MSC làm tăng nhanh liền vết thương ở cả vết thương cấp tính ở chuột có tăng và không gây tăng đường máu và cả ở vết thương cấp tính trên người [26].

Các nghiên cứu gần đây gợi ý rằng, MSC có khả năng tiết ra nhiều cytokin và các chất hóa ứng động khác nhau vốn có vai trò quan trọng cho hoạt động sửa chữa mô, thậm chí trên cả các mô hình tổn thương thận và não [73]. MSC làm nhanh quá trình liền vết thương là do ít nhất có 2 cách thức khác nhau bao gồm thông qua tăng biệt hóa tế bào và thông qua các tín hiệu ngoại lai. Các MSC tủy xương đã được báo cáo là có thể biệt hóa thành tế bào sừng trong các nghiên cứu có sử dụng EGFP [82]. Trong các vết thương này, một phần trăm các tế bào có biểu hiện EGFP dương tính ở cả trung bì và biểu bì cũng có biểu hiện với keratin vốn là marker chuyên biệt của tế bào sừng. Tuy nhiên, với tỷ lệ được đưa ra là quá thấp nên MSC vẫn chưa được coi chắc chắn là có trách nhiệm đối với quá trình sửa chữa mô thông qua tăng biệt hóa chuyển dạng và tái sinh hoặc phá hủy mô [58], [82]. Những chứng cớ tích cực hơn cũng đã cho thấy, MSC có thể thúc đẩy liền vết thương thông qua các tín hiệu ngoại lai được tiết ra mà cải thiện các đáp ứng với tổn thương của các tế bào da cư trú tại đó. Các báo cáo gần đây bắt đầu xác định những tương tác ngoại lai này giữa MSC và các dạng tế bào chuyên biệt khác trong vết thương da [15], [22], [81]. Khi nghiên cứu các vết thương được điều trị bằng dịch nổi nuôi cấy MSC (dịch chiết ngoại bào MSC), các tác giả nhận thấy dịch chiết ngoại bào MSC đã làm vết thương nhanh đóng kín và nó tăng hấp dẫn với các đại thực bào và các tế bào nội mô đầu dòng thâm nhập đến vết thương [22] và các thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng dịch ngoại bào MSC cũng thúc đẩy tế bào sừng và tế bào nội mô tăng sinh. Hơn nữa, MSC tủy xương còn tiết ra các chất hóa ứng động với đại thực bào, tế bào sừng và các tế bào nội mô. Các quan sát này rõ ràng chỉ ra rằng MSC tủy xương là một nguồn các tín hiệu ngoại lai có tác dụng điều khiển các đáp ứng tế bào quan trọng trong sửa chữa vết thương da.

Do đó, một trong những hướng nghiên cứu khác trong điều trị vết thương là sử dụng các tế bào gốc. Người ta thấy chúng đảm nhiệm việc đánh giá sự thiếu hụt sinh lý học về các thành phần đệm và các cytokine, chúng sửa chữa các thiếu hụt đó bằng cách tạo ra những yếu tố thích hợp thúc đẩy liền vết thương. Điều này có nghĩa là tế bào gốc hoạt động như một cỗ máy có kiểm soát tương tác các thông tin ngược một cách thông minh có thể tự điều chỉnh hệ thống sinh học. Tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn đều đã được nghiên cứu sử dụng trong điều trị vết thương mạn tính để thúc đẩy các đáp ứng liền vết thương [75].

Tế bào gốc là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới. Đây là các tế bào còn chưa hay rất ít biệt hoá nên chúng có khả năng biệt hoá theo nhiều hướng và tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau. Ngoài ra, chúng cũng có khả năng tự sinh ra các tế bào giống hệt nó. Thông thường các tế bào phân chia theo phương thức nhân đôi đối xứng tạo ra hai tế bào giống hệt nhau về mức độ biệt hoá. Tế bào gốc không chỉ có khả năng phân chia đối xứng mà còn có khả năng phân chia không đối xứng thành hai tế bào khác nhau, trong đó một tế bào giữ nguyên mức độ biệt hoá cũng như giữ nguyên vai trò là tế bào gốc và một tế bào thứ hai đã biệt hoá hơn, chúng sẽ tiếp tục biệt hoá thành các tế bào tiền thân để sau đó phát triển thành tế bào chuyên biệt tham gia vào cấu trúc và chức năng của mô, cơ quan. Nhờ đó mà số lượng tế bào gốc được duy trì hoặc tăng lên chứ không mất đi do quá trình biệt hoá tế bào.

Những nghiên cứu về tế bào gốc đã chứng minh, hàng ngày cơ thể chúng ta thay thế những tế bào già chết là do nguồn tế bào gốc biệt hoá thành những tế bào chức năng. Khi bị thương các tế bào gốc từ các ổ (niche) có thể ở gần vết thương hoặc từ các mô khác nhau như tuỷ xương… sẽ di cư đến và biệt hoá thành các tế bào chuyên biệt có chức năng liền vết thương. Khi nguồn tế bào gốc này không đủ đáp ứng với những tổn thương tế bào do tổn thương diện tích rộng, do cơ thể bị suy yếu… thì hậu quả là gây ra những vết thương vết loét lâu lành, thậm chí không liền được. Do đó công nghệ tế bào gốc đang mang lại những hy vọng lớn trong việc khắc phục những nan giải hiện nay trong liền vết thương.

Những tế bào gốc phôi có tiềm năng lớn thay thế toàn bộ các tế bào chức năng của cơ thể. Nhưng việc sử dụng tế bào gốc phôi vào lĩnh vực liền vết thương hay bất cứ lĩnh vực nào khác đang gặp phải những vấn đề về đạo đức, cần có nguồn thay thế. Hơn nữa, một báo cáo gần đây cho thấy tế bào gốc phôi của người trong nuôi cấy có biểu hiện protein không phải của người và giả thiết đặt ra là có thể từ protein chuột từ fibroblasts chuột của lớp nuôi (feeder layer), do đó tính an toàn của tế bào gốc phôi còn phải tiếp tục nghiên cứu [51].

Một số nguồn tế bào gốc khác nhau từ máu cuống rốn, tế bào gốc máu ngoại vi và tuỷ xương cũng đang được nghiên cứu [19], [32], [37], [75]. Một nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ bFGF và VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xương cao hơn rất nhiều so với fibroblasts trung bì. Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xương tại chỗ vết thương để thúc đẩy liền vết thương.

Một nghiên cứu trên in vivo chỉ ra rằng sự tổng hợp collagen và mức độ bFGF và VEGF trong tế bào Stroma của tuỷ xương cao hơn rất nhiều so với fibroblasts trung bì. Điều này gợi ý khả năng sử dụng tế bào tuỷ xương tại chỗ vết thương để thúc đẩy liền vết thương [32].

Tuy nhiên có tác dụng liền vết thương vết bỏng nhưng các nguồn tế bào gốc từ các mô của cơ thể như máu tuỷ xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn, não, mỡ, gan… đều rất hạn chế về số lượng nên tính ứng dụng chưa cao. Trong khi đó, khai thác các nguồn tế bào gốc trung mô trưởng thành cũng đang là một trong những hướng nghiên cứu điều trị vết thương. Ngoại trừ các trường hợp ghép tế bào gốc trung mô đồng loại vốn sẵn có nguồn tế bào rất trẻ như tế bào gốc trung mô từ màng ối, dây rốn và máu cuống rốn thì đối với các trường hợp ghép tế bào gốc trung mô tự thân chỉ có thể lấy từ 2 nguồn chính là tủy xương và mô mỡ, các nguồn khác từ mô gan, não và cơ hầu như không có khả năng ứng dụng trong điều trị vết thương. Nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương chủ yếu là tế bào gốc tạo máu đã và đang được ứng dụng trong điều trị các bệnh về cơ quan tạo máu nhưng chúng có rất ít các tế bào trung mô vốn tham gia vào việc tái tạo vết thương. Tuy có một số nghiên cứu cho thấy tế bào gốc trung mô tủy xương làm tăng khả năng liền vết thương mạn tính nhưng tính ứng dụng chưa cao bởi rất hạn chế về số lượng tế bào trung mô. Do đó tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được coi là nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho các nghiên cứu về y học tái tạo, công nghệ mô và liền vết thương.

Tế bào gốc mô mỡ được xác định là tế bào gốc trung mô. Tế bào gốc trung mô lần đầu tiên được mô tả là dạng tế bào từ tủy xương có khả năng tạo dòng, bám dính bề mặt nuôi cấy [31] mà có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào sụn và tế bào xương [56]. Sau đó , chúng được xác định là có mặt ở rất nhiều mô cơ quan khác nhau như cơ, não, và mô mỡ [52]. Ngày nay, tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ được xác định là rất giống nhau về quần thể tế bào và kiểu hình tế bào [52].

Tế bào gốc đa tiềm năng đã được phát hiện trong mô mỡ của người và được gọi là tế bào gốc mô mỡ. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng tế bào gốc mô mỡ có thể điều trị một số bệnh về khớp, mà liệu pháp điều trị khác không thành công. Mô mỡ còn được sử dụng để tạo hình một số bộ phận trong cơ thể như ngực, má, cằm. Đây được coi như là cuộc cách mạng trong lĩnh vực tạo hình thẩm mỹ. Tế bào gốc mô mỡ thể hiện các đặc điểm của tế bào gốc trung mô như hình thái dạng nguyên bào sợi, là tế bào bám bề mặt nuôi cấy, có các dấu ấn biệt hóa của tế bào trung mô, có khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào cơ…Do mô mỡ là loại mô sẵn có với số lượng lớn và dễ dàng thu hồi mà ít gây những bất lợi cho bệnh nhân nên tế bào gốc mô mỡ có thể sẽ là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tương lai đặc biệt các trường hợp sử dụng ghép tự thân. Các nhà nghiên cứu đề xuất nhiều cách thức phân lập tế bào gốc mô mỡ khác nhau, có tác giả phân lập theo cách kinh điển là nuôi mô mỡ trong đĩa nhựa có môi trường dinh dưỡng và chờ cho tế bào tự mọc từ các mẩu mô ra và thu các tế bào có hình sao hoặc hình thoi là tế bào gốc trung mô. Có tác giả lại dùng collagenase để phá hủy cấu trúc mô sau đó ly tâm lọc lấy các tế bào. Môi trường nuôi cấy cũng được công bố theo nhiều công thức khác nhau, các tác giả dùng môi trường cơ bản khác nhau như DMEM, DMEM-F12, CMRL1066... ngay DMEM thì cũng có tác giả dùng môi trường cơ bản là DMEM có hàm lượng glucose cao nhưng có tác giả dùng môi trường có hàm lượng glucose thấp, hoặc như thành phần các yếu tố bổ sung cũng chưa thống nhất... Khối tế bào thu được có thành phần tế bào khác nhau gồm tế bào gốc trung mô, tế bào máu... có tác giả sử dụng nguyên khối tế bào sau khi phân lập để điều trị vết thương nhưng cũng có tác giả sử dụng có chọn lọc chỉ tế bào gốc trung mô thuần nhất... Cách thức sử dụng tế bào để tăng tối đa hiệu quả các lần ghép điều trị vết thương cũng khác nhau, có tác giả dùng khối tế bào tiêm vào vết thương, có tác giả phun hỗn dịch tế bào lên vết thương nhưng cũng có tác giả nuôi cấy tế bào gốc trung mô trên giá đỡ và ghép vào bề mặt vết thương. Chính vì các lý do trên mà cần có những nghiên cứu đánh giá để xây dựng nên quy trình phù hợp cũng như tiêu chuẩn khối tế bào dùng điều trị cũng như chỉ định hay cách thức sử dụng tế bào gốc trung mô trong điều trị vết thương.

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng của tế bào gốc mỡ đối với các bệnh liên quan đến liền vết thương. Theo Hyoju Kim và cộng sự (2012) điều trị bằng laser công suất thấp với cấy ghép tế bào gốc mỡ trên chuột hủy miễn dịch. Nhóm tác giả cho rằng sự kết hợp này tăng cường phản ứng của tế bào về biểu hiện gen và sự bài tiết của các yếu tố tăng trưởng và phát triển tế bào thông qua màng ty thể, giúp tăng đáng kể số lượng nang lông và tuyến bã nhờn[39]. Sheng-Ping Huang (2013), trên chuột Sprague-Dawley bị gây loét bằng chùm tia điện tử sau đó được điều trị bằng ghép tế bào gốc mỡ. Kích thước vết thương sau khi điều trị nhỏ hơn đáng kể sau 3 tuần. Tác giả cho rằng tế bào gốc mỡ có liên quan với sự phát triển của các mạch máu mới [69]. Ann Katharin Reckhenrich và cộng sự (2014), chậm liền vết thương và hình thành sẹo là một trong những biến chứng thường gặp nhất sau khi can thiệp phẫu thuật. Do vậy sử dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ như một nhân tố trung gian trong việc kích hoạt vật liệu sinh học giúp liền các vết khâu phẫu thuật [62].

Trong công nghệ sinh học da, mục đích cuối cùng trong nghiên cứu và điều trị là để nhanh chóng tạo ra một cấu trúc hoàn hảo phục hồi hoàn toàn chức năng da.

Trong số bệnh nhân bỏng, có nhiều bệnh nhân bỏng nặng không đủ nguồn da thay thế đã dẫn đến suy mòn, suy kiệt và tử vong. Viện Bỏng Quốc Gia trong 5 năm đã nghiên cứu trị liệu tế bào trong điều trị vết thương vết bỏng, các tấm tế bào da nuôi cấy đã được chế tạo và sử dụng trong điều trị đạt nhiều kết quả tốt góp phần cứu sống những bệnh nhân bỏng sâu diện rộng hoặc tổn thương khuyết da rộng hoặc những bệnh nhân vết thương mạn tính lâu liền.

Viện Bỏng Quốc Gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào sừng để điều trị vết thương và vết bỏng. Tuy nhiên, việc nuôi cấy tế bào da tự thân không đáp ứng kịp nhu cầu lâm sàng do quy trình cần thời gian dài, việc nuôi cấy các tế bào da đồng loại đáp ứng kịp thời về mặt thời gian nhưng gặp phải vấn đề thải ghép. Mô mỡ tự thân dễ dàng lấy hơn, nhất là vùng bụng rất thích hợp để nuôi cấy tế bào gốc mỡ [41].

Xuất phát từ các cơ sở khoa học và thực tiễn về tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, cần thiết phải nghiên cứu thiết lập quy trình chuẩn và có hiệu quả tách tế bào cao nhất, các tế bào cần được tinh lọc và thể hiện tính gốc như khi chúng tồn tại trong cơ thể người. Việc đánh giá tác động của nguồn tế bào gốc sau khi tách tới sự tăng sinh và di cư của cả 2 loại tế bào da gồm nguyên bào sợi và tế bào sừng là cơ sở tiếp tục cho việc định hướng và chế tạo chế phẩm điều trị vết thương trong tương lai.

Tế bào gốc mô mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào xương, tế bào tiết insulin, tế bào sụn [45], [84], [85]. Tác giả Xu W (9-2014) đã biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào dạng nguyên bào sợi để điều trị vết thương ở thanh quản [36].

Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thương.

Trước khi ứng dụng tế bào gốc trung mô vào lĩnh vực điều trị vết thương, cần đánh giá tiền lâm sàng bằng các thử nghiệm trong labo về tác động của chúng đối với các tế bào da như nguyên bào sợi và tế bào sừng. Nếu như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết bỏng.

Tế bào gốc trung mô có các dấu ấn bề mặt và dấu ấn gen tương tự như tế bào gốc trung mô tủy xương. Điều thuận lợi hơn là tế bào gốc mô mỡ lại dễ phân lập và có khả năng tăng sinh mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô tủy xương. Do đó, tế bào gốc mô mỡ có nhiều hy vọng được ứng dụng rộng rãi trong sửa chữa và tái tạo mô.

Khám phá vai trò của tế bào gốc mô mỡ đối với liền vết thương da, chúng tôi khảo sát liệu tế bào gốc mô mỡ và sự tương tác qua tiếp xúc tế bào giữa tế bào gốc mô mỡ với nguyên bào sợi da và tế bào sừng của người có thúc đẩy sự tăng sinh và di cư không. Hơn nữa, sự tiết collagen được đánh giá và hoạt động di cư của nguyên bào sợi cũng như tế bào sừng được nghiên cứu trên mô hình vết thương thực nghiệm in vitro.

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

ADSCs: tế bào gốc được phân lập từ mẫu mô mỡ. 30 mẫu mô mỡ được thu từ bệnh nhân di chứng bỏng cần phẫu thuật ghép da.

Tế bào sừng và nguyên bào sợi đã được phân lập từ mẫu da thu từ phẫu thuật cắt bỏ bao quy đầu của 05 trẻ em.

Các bệnh nhân hoặc người nhà bệnh nhân này đều đồng ý hiến phần mỡ hoặc phần da bỏ đi dùng cho nghiên cứu và được chấp nhận bởi ban đạo đức nghiên cứu y sinh bệnh viện. Tiêu chuẩn người hiến mô đạt yêu cầu về sàng lọc HIV, HBsAg, HCV và giang mai với test nhanh âm tính.

Tiêu chuẩn về pháp lý: Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân đồng ý hiến phần mô bỏ đi trong các phẫu thuật điều trị di chứng bỏng. Các mẫu hồ sơ hiến mô được ghi chép theo quy định của Bộ Y tế được hội đồng đạo đức trong nghiên cứu sinh y của Viện Bỏng Lê Hữu Trác thông qua.

2.1.2. Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu

- DMEM và DMEM-F12 do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Huyết thanh bào thai bê (FBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Collagenase do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Epilife do hãng Gico/Life tech cung cấp

- EDGS do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Antibiotic/Antimycotic do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Trypsin/EDTA do hãng Gico/Life tech cung cấp

- Phosphate bufferd saline (PBS) do hãng Gico/Life tech cung cấp

2.1.3. Trang thiết bị và vật tư

- Máy ly tâm, bể ổn nhiệt

- Tủ ấm CO₂ (Incubator) hoạt động ở 37⁰C, CO₂ 5%

- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu

- Kính hiển vi đảo ngược

- Thiết bị để thanh trùng khô, thiết bị thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực)

- Ống ly tâm falcol thể tích 15ml, 50ml, falcol do hãng Corning cung cấp

- Đĩa petri đường kính 60mm, 100mm do hãng Corning cung cấp

- Pipet aid, đầu pipet loại 5ml, 10ml, 25ml

- Găng tay vô trùng

- Các dụng cụ khác

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào

Mô mỡ dưới da được lấy vô trùng từ phòng mổ và bảo quản ngay trong tube môi trường, giữ ở 4⁰C và vận chuyển về labo. Môi trường bảo quản mô mỡ bao gồm DMEM có 500U/ml penicillin, 500microgam/ml streptomycin và amphotericin B.

Xử lý mô mỡ và phân lập tế bào gốc tại labo nuôi cấy tế bào:

- Rửa mô mỡ 3 lần bằng PBS để loại bỏ các cấu trúc thuộc mạch máu, da...

- Mô mỡ được phân tách bằng Collagenase, nồng độ collagenase trong tube mô mỡ là 0.15%.

- Đặt tube hỗn dịch trên vào incubator khoảng 30 phút, cứ sau 10 phút lại lắc một lần, sau 30 phút thêm FBS để dừng tác dụng của enzym

- Ly tâm tốc độ 1500rpm trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi và thu được tế bào lắng dưới đáy tube.

- Đếm số lượng tế bào thu được trong buồng đếm Nauebaer để xác định nồng độ tế bào có trong hỗn dịch thu được.

- Cấy vào đĩa petri sao cho đạt 20.000 TB/cm² bề mặt nuôi cấy.

- Mỗi đĩa d=100mm sau đó được bổ sung ít nhất đủ 8ml môi trường DMEM/1% kháng sinh/10% FBS

- Đặt đĩa vào incubator ẩm, nhiệt độ 37⁰C và CO₂ 5%

- Quan sát tế bào và tiến hành thu tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin khi mật độ tế bào đạt 80% diện tích che phủ.

- Các tế bào thu được sau đó được đếm xác định số lượng. Sau đó, bảo quản lạnh sâu hoặc cấy trở lại đĩa nuôi với mật độ 5000 TB/cm² cho tới thế hệ thứ 5 để cung cấp cho nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2. Nhân rộng tế bào

- Kiểm tra tình trạng tế bào, đánh giá mức độ che phủ của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy (độ che phủ đạt khoảng 70% có thể cấy chuyển làm thí nghiệm)

- Hút bỏ dịch nổi trong đĩa nuôi cấy rồi đem rửa bằng dung dịch đệm PBS

- Thêm dung dịch Trypsin/EDTA 1X với thể tích 0,1ml/cm², đặt đĩa nuôi cấy vào tủ ấm với tiêu chuẩn nhiệt độ 37⁰C, CO₂ 5% trong 5 phút. Sau khi lấy ra ngừng quy trình trypsin bằng 0,1 ml/cm² môi trường nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lượng tế bào.

- Ly tâm ở tốc độ 1600 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm và bổ sung môi trường nuôi cấy.

- Khối tế bào thu được cấy chuyển sang đĩa khác để gia tăng số lượng tế bào hoặc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.