TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN

-------------------------

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. 
   TS. Đinh Văn Hân
   
2. 
   PGS. TS. Ngô Giang Liên
   

Hà Nội - 2014

Tế bào gốc mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng khác nhau. Mô mỡ là loại mô có sẵn với số lượng lớn và dễ dàng thu hồi nên đây là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tương lai có thể sử dụng để ghép tự thân và đặc biệt là không gặp phải những vấn đề y đức. Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thương thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế bào quan trọng di cư đến vùng tổn thương để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thương.

Tế bào gốc trung mô đã được nghiên cứu tách từ mô mỡ nhưng trong thành phần tế bào được tách còn nhiều dạng tế bào khác như bạch cầu, hồng cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định chính xác cần sử dụng bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế bào trong hỗn dịch tế bào mới tách là đủ để cho một lần ghép điều trị vết thương. Do đó, cần nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mô. Nếu như các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cư của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hướng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thương thuộc hệ thống trung mô đặc biệt là vết thương và vết bỏng.

Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, cụ thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang các vết thương mạn tính. Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 người cần được điều trị bằng da nhân tạo. Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu người bị loét và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị.

Tại Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn về bỏng [8]. Tuy chưa có con số thống kê cụ thể nhưng chỉ tính riêng tại Viện Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị thì nhu cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau:

1. 
   Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều kiện nuôi cấy invitro
   
2. 
   Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy
   

Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu, viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo [3]. Tuy quá trình liền vết thương có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thương. Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con người cần có da. Thành phần tế bào da người chủ yếu bao gồm 2 loại là nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào sừng (Keratinocytes). Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì. Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thương da. Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thương tăng sinh che phủ bề mặt làm lành vết thương.

(Nguồn: Werner S et al (2003), Physiol. Re;83:835-870), [79].

1. 
   12-24 giờ sau bị thương, nguyên bào sợi quanh tổn thương được kích hoạt.
   
2. 
   Từ 3-7 ngày sau bị thương, nguyên bào sợi di cư vào vùng tổn thương, tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào.
   

Như chúng ta đã biết da là cơ quan lớn nhất của cơ thể và có vai trò là một cơ quan bảo vệ cơ thể trước các tác động với môi trường xung quanh. Da bảo vệ các cơ quan phía dưới da và bảo vệ cơ thể chống lại các mầm bệnh và vi sinh vật. Da trực tiếp tiếp xúc với các yếu tố độc hại tiềm tàng như vi khuẩn, nhiệt, các tác động cơ học và hóa học. Trong 25 năm qua, các cố gắng lớn đã tạo ra các vật liệu thay thế mang tính bắt chước da người [50]. Ở da công nghệ mô, các vật liệu tổng hợp hay sinh học được kết hợp với các tế bào nuôi cấy để tạo ra các mô có chức năng của da [74].

Các vật liệu thay thế da này được chế tạo dựa trên các tiến bộ về công nghệ mô và đã được ứng dụng trong lâm sàng, chúng thúc đẩy sự liền vết thương cấp và mạn tính và được sử dụng như một cơ quan phức hợp cho hệ thống thử nghiệm cơ bản hoặc các nghiên cứu về dược [59]. Một vấn đề chính trong việc tăng sinh tế bào là đáp ứng yêu cầu cần đạt đủ số lượng các tế bào cần thiết, trong khi vẫn đảm bảo được tính chất bình thường của tế bào và cả chức năng của chúng. Các tế bào này sau đó chỉ được sử dụng cho các mục đích hoặc là tạo vật liệu thay thế da phù hợp cho cấy ghép hoặc là cho các thử nghiệm in vitro [27], [66].

Có rất nhiều lý do gây nên tổn thương da bao gồm các hội chứng do gen, chấn thương cấp tính, vết thương mạn tính hoặc các can thiệp ngoại khoa. Một trong các lý do phổ biến nhất là tổn thương da do bỏng. Ngay khi da bị tổn thương, hàng loạt các vấn đề phức hợp bắt đầu diễn ra: các tế bào miễn dịch bị lôi kéo tới vùng thương tổn, mô đệm mới được sinh ra bởi nguyên bào sợi, tiếp theo là tái biểu mô hóa do tế bào sừng đảm nhiệm và cuối cùng là sự tái phân bố mạch của vết thương [54]. Quá trình liền vết thương phức tạp này được kích thích và kiểm soát bởi các cytokine và các yếu tố tăng trưởng khác nhau [25]. Kích thước vết thương là yếu tố chủ đạo cho biểu mô hóa. Tổn thương toàn bộ lớp da với kích thước lớn hơn 1 cm đường kính thì cần phải ghép da để đề phòng tạo sẹo dẫn đến di chứng về chức năng hay thẩm mỹ [55]. Mảnh ghép hoàn hảo nên phải sẵn có, không gây đáp ứng miễn dịch, che phủ và bảo vệ nền vết thương, làm tăng nhanh liền vết thương, ít gây đau và ít tạo sẹo.

Trong trường hợp tổn thương diện tích rộng các tế bào có chức năng liền vết thương của bệnh nhân không đủ khả năng làm lành tổn thương mà cần phải ghép da tự thân nhưng nguồn da tự thân cũng không phải vô hạn nên ghép da tự thân cũng chỉ cứu được những bệnh nhân bỏng sâu 50% diện tích cơ thể là chủ yếu.

Trong lĩnh vực điều trị bỏng và chấn thương lớn, mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong cứu chữa như cắt hoại tử - ghép da ngay, tăng độ giãn rộng của da ghép [14], sử dụng da đồng loại hay các vật liệu thay thế da khác nhau [9], [10], [11], [12] nhưng các rối loạn về protein, thay đổi hệ thống miễn dịch... làm cho vết thương trở nên chậm lành hay rất khó lành [2], [7].

Ngoài ra chúng ta còn gặp các loại vết thương mạn tính rất khó lành như các vết loét do tiểu đường, loét do viêm tắc tĩnh mạch, loét điểm tỳ, loét xạ trị… mà không thể can thiệp bằng phẫu thuật ghép da nguy cơ thất bại rất cao do khả năng tiếp nhận mảnh ghép của vết thương rất kém và tình trạng bệnh nhân không cho phép phẫu thuật. Số lượng bệnh nhân này ngày càng tăng cao cùng sự phát triển kinh tế - xã hội và tuổi thọ con người [10], [26]. Các vết thương này bị gián đoạn giai đoạn tăng sinh hoặc tế bào tham gia liền vết thương bị chuyển dạng [7], [9], [13], [23], [38]. Để khắc phục hạn chế này nhằm thay thế các tế bào đã tổn thương, công nghệ nuôi cấy tế bào da phát triển.

Từ những năm trước, một số nhà nghiên cứu cho rằng điều trị vết thương vết bỏng trong tương lai sẽ trở nên đơn giản, nhanh chóng và dễ dàng che phủ tổn thương sau cắt hoại tử. Nhưng thực tế, điều đó còn rất xa vời. Khái niệm này đã dẫn đến một số quan niệm sai trầm trọng dẫn đến việc đưa ra những hứa hẹn quá sớm về công nghệ mô da mà chậm được nhận ra trên thực tế lâm sàng. Khái niệm sai này là coi da như một mô giống như xương sụn và sẽ liên quan đơn giản tới nơi có thay đổi về công nghệ mô. Dù da không phải là một mô nhưng là một tổ chức hoàn toàn tổng hợp mang đến bởi sự kết hợp tế bào từ 3 nguồn gốc phôi gồm ngoại bì trung bì và ống thần kinh. Những thành công hiện đại về tạo ra những sản phẩm thay thế da đã trở nên bị hạn chế hơn so với mong đợi và bây giờ những sản phẩm da công nghệ mô đang được mô tả như vật liệu thay thế da giúp liền vết thương và sửa chữa, thay thế da tạm thời và thường hỗ trợ cho việc tái sinh. Quá trình liền vết thương, vết bỏng có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập các mô tế bào đã bị tổn thương. Do đó, quan niệm mới trong điều trị các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trên cơ thể là các tế bào tổn thương phải được thay thế bằng các tế bào khỏe mạnh [4].

Cho đến ngày nay, người ta đã chế tạo được các tấm nguyên bào sợi, tấm tế bào sừng, thậm chí cả các tấm vật liệu chứa cả hai loại tế bào trên mà người ta gọi là các vật liệu tương đương da hoặc da nhân tạo…[57], [70]. Tuỳ theo nguồn gốc tế bào sừng trên tấm vật liệu là tự thân hay khác gen đồng loài (gọi tắt là đồng loài) mà người ta chế được vật liệu có tính chất vĩnh viễn (không thải ghép) hoặc tạm thời.

Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tương đương da được ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thương mạn tính trong thẩm mỹ và nghiên cứu thuốc…. So với ghép da tử thi, các vật liệu này có thuận lợi lớn là không phụ thuộc nguồn da người cho, việc sản xuất chúng gần như vô hạn và hầu như không có nguy cơ lây nhiễm bệnh do có thể kiểm soát trước được nguồn cho tế bào bằng các xét nghiệm tầm soát các bệnh lây truyền qua ghép mô/tế bào. Có hai thành phần chính của vật liệu tương đương da là thành phần khuôn và thành phần tế bào. Thành phần khuôn hay được sử dụng là collagen, acid hyaluronic, polymer tổng hợp hoặc sinh tổng hợp. Thành phần tế bào bao gồm các tế bào da như nguyên bào sợi, tế bào sừng là hai tế bào chủ yếu, ngoài ra có thể có tế bào sắc tố… Đã có những sản phẩm thương mại sẵn có trên thị trường như Epicell, Integra, Transcyte, Apligraft, Dermagraft…

Trị liệu tế bào nói chung đã mang lại một số kết quả đáng kể trong lâm sàng, một số tế bào được nuôi cấy và ứng dụng phổ biến là: