TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN

Phương pháp này sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer.

Sau khi tiến hành quy trình trypsin, lấy 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin pha tỷ lệ 1:1 với chất nhuộm màu Trypan-blue. Hút hỗn dịch tế bào và chất nhuộm màu bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm. Đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi.

Số lượng TB được tính theo công thức: C = n/v

n: số lượng TB đã đếm được trong buồng đếm

v: thể tích đếm (ml)

C: mật độ tế bào (TB/ml).

Buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm³ = 1.10^-4 ml do đó công thức tính là:

Để xác định tính gốc của tế bào thông qua khả năng tự đổi mới của chúng, hỗn dịch các tế bào đơn lẻ được chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy nhựa có đường kính 60mm ở mật độ là 50 TB/cm². Đĩa nuôi cấy sau đó được duy trì trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony. Đĩa tế bào nuôi cấy sau đó được cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào được xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào. Khả năng tạo dòng được tính toán theo tỷ lệ % số colony đạt được so với số tế bào được cấy. Cụ thể các bước tiến hành như sau:

Bước 1. Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa có đường kính 60mm với mật độ tế bào 50TB/cm², mỗi đĩa cho 4mm môi trường nuôi cấy, thay môi trường sau mỗi 3 ngày.

Bước 2. Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:

• 
  Hình thành colony chưa?
  
• 
  Mỗi colony có khoảng bao nhiêu tế bào?
  
• 
  Hình thái tế bào?
  

Bước 4. Tính tỷ lệ % số colony/số tế bào được cấy, mỗi colony khi đó được xác định là có từ 50 tế bào trở lên.

Để xác định hiệu quả của các yếu tố hòa tan bởi ADSCs lên sự tăng sinh và di cư của hai loại tế bào, nguyên bào sợi da và tế bào sừng được đồng nuôi cấy với tế bào gốc mô mỡ trong 2 khoang đĩa để tránh sự tiếp xúc trực tiếp giữa các loại tế bào nhưng lại cho phép sự trao đổi các yếu tố có khả năng khuếch tán.

Tế bào gốc mô mỡ được cấy trên insert chứa màng polycarbonate của đĩa transwell, màng polycarbonate có kích thước lỗ là 0,45micromet và được tráng collagen, nguyên bào sợi và tế bào sừng được cấy ở khoang phía dưới. Ảnh hưởng của tấm tế bào gốc mỡ đến hai loại tế bào da nuôi cấy này được đánh giá qua sự tăng sinh tế bào da và khả năng di cư của chúng theo cách thức mô tả dưới đây.

Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×10⁴ TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm DMEM/1%FBS/1%AB.

Nguyên bào sợi được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh.

Tế bào MSC được cấy trên insert với mật độ 5000 TB/cm² và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 11 ngày trước khi đồng nuôi cấy với nguyên bào sợi, khi đó MSC đạt 70-80% độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa.

Tấm tế bào gốc trung mô chứa cả insert sau đó được đặt vào các giếng nguyên bào sợi và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy MSC mới.

Thí nghiệm đối chứng gồm:

1. 
   Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào.
   
2. 
   Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x10³TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSC trong 6 ngày trước khi đồng nuôi cấy.
   

Với tất cả các thí nghiệm, nguyên bào sợi da được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 5×10⁴ TB/giếng và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô bao gồm Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) được bổ sung 2mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml amphotericin B (Invitrogen/GIBCO), 10% FBS (PAA).

Nguyên bào sợi được cấy trong 6 ngày (đạt 90% độ che phủ) trước khi đồng nuôi cấy để phân tích di cư làm liền vết cạo.
Mô hình thí nghiệm đồng nuôi cấy

Nguyên bào sợi/ tế bào sừng nuôi cấy trong giếng trong 6 ngày, mật độ cấy 50.000TB/giếng

Từ các thí nghiệm phân tích chúng tôi xây dựng được quy trình các bước thí nghiệm đánh giá tác động của tấm tế bào gốc mô mỡ như sau:

Với tất cả các thí nghiệm, tế bào sừng được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 3×10⁴ TB/giếng trong môi trường Epilife được bổ sung EDGS trong 24 giờ để tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy. Sau đó tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS. Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích tăng sinh.

Tế bào gốc mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm² và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80%-90% độ che phủ.

Tấm tế bào gốc mỡ cả insert sau đó được đặt vào các giếng tế bào sừng và bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ là DMEM chỉ có 2% FBS.

Thí nghiệm đối chứng gồm:

1. 
   Nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào.
   
2. 
   Insert có tế bào là nguyên bào sợi da cấy ở mật độ 5x10³ TB/insert và duy trì trong môi trường tăng sinh MSC trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy.
   

Tế bào sừng được cấy trong 3 ngày trước khi đồng nuôi cấy để phân tích di cư. Với tất cả các thí nghiệm, tế bào sừng được cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 3x10⁴ TB/giếng và duy trì trong môi trường Epilife được bổ sung EDGS. Môi trường nuôi cấy được thay thế sau mỗi 2 ngày và theo dõi cho đến khi tế bào sừng đạt 100% độ che phủ (3 ngày) thì dùng đầu pipet cạo bề mặt tế bào để tạo các khoảng trống tương tự nhau, rửa tế bào bằng PBS. Sau đó, tế bào sừng chỉ được nuôi cấy trong môi trường Epilife mà không có EDGS.

Tế bào gốc mô mỡ trên insert với mật độ 5000 TB/cm² và duy trì trong môi trường tăng sinh tế bào gốc trung mô như trên trong 5 ngày trước khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, khi đó tế bào gốc mỡ đạt 80%-90% độ che phủ và vẫn ở tình trạng chưa biệt hóa.

Tấm tế bào gốc mô mỡ cả insert sau đó được đặt vào các giếng tế bào sừng. Khoang trên là tấm tế bào gốc mô mỡ được bổ sung ngập trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ là DMEM với 2% FBS. Khoang dưới là tế bào sừng với vết cạo đồng kích thước được duy trì trong môi trường Epilife đơn thuần.

Thí nghiệm đối chứng gồm 1/ nguyên bào sợi đồng nuôi cấy với insert không có tế bào, 2/ insert có tế bào là nguyên bào sợi da và duy trì trong môi trường tương tự với tế bào gốc mô mỡ là DMEM với 2% FBS.

Cứ sau mỗi 24 giờ, các vết cạo ở khoang tế bào sừng được chụp ảnh và phân tích khoảng cách thu hẹp do tế bào sừng di cư.

A	B
C	D

Từ các thí nghiệm phân tích chúng tôi xây dựng được quy trình các bước thí nghiệm đánh giá tác động của tấm tế bào gốc đến tế bào sừng như sau:

Tế bào gốc được cấy trên các giá đỡ là các tấm vật liệu nuôi cấy hoặc che phủ vết thương. Khi tế bào bám dính và đạt mật độ yêu cầu, tấm vật liệu được sử dụng trong phân tích và đánh giá tác dụng. Các bước cụ thể như sau:

- ADSCs được tinh lọc và nhân rộng nhờ các lần cấy chuyển đến P5 thì sử dụng để chế tạo tấm tế bào gốc.

- Tế bào được cấy trên màng polycarbonat có kích thước lỗ 3µm và được tráng collagen typ I. Mật độ tế bào cấy ban đầu là 50TB/cm².

- Duy trì tế bào trong môi trường nuôi cấy ADSCs như đã mô tả bao gồm: DMEM có 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml amphotericin B.

- Các đĩa nuôi cấy được đặt trong tủ ấm ẩm ở 37⁰C có 5% khí CO₂.

- Môi trường nuôi cấy được thay sau mỗi 3 ngày và theo dõi sự phát triển của tế bào qua kính hiển vi đảo ngược.

- Khi tế bào đạt 90% độ che phủ thì coi như tấm tế bào đã được chế tạo và bắt đầu cho các thử nghiệm tiếp theo.

Xử lý mô mỡ để phân lập tế bào gốc trung mô

A	B
C	1 2 3 D

Chỉ tiêu	Giá trị
	Min-Max	± SD
Số lượng tế bào thu được/gam mô	2,4x106 - 2,7x106	2,46x106 ± 1,4
Tỷ lệ % tế bào sống	96,3 - 97,2	96,4 ± 1,7

Với các mẫu mô xử lý và phân lập thành công, số lượng tế bào thu được sau khi xử lý mẫu mô trung bình là 2,4x10⁶ ± 1,4/gram mô.

Tỉ lệ tế bào sống trung bình là 96,4± 1,7%.

Tế bào cơ bản có hình dạng tương tự như nguyên bào sợi có hình sao với các nhánh bào tương dài.

Các tế bào thuộc loại tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy của đĩa nhựa, và chỉ tạo đơn lớp, không thấy có sự chồng lấn lên nhau kể cả khi đã đạt 100% độ che phủ.

Tế bào gốc mỡ bắt đầu dính xuống bề mặt nuôi cấy sau khoảng 4-6 giờ khi đĩa nuôi được đặt trong tủ ấm 37⁰C và 5% khí CO­₂.

Đầu tiên, hình dạng tế bào là hình tròn nhỏ hoặc hình không xác định được quan sát thấy cùng với một số tế bào máu đơn nhân.

Dần dần, các tế bào bẹt và giãn rộng ra xung quanh và có hình thoi dài hoặc ngắn và sau đó là hình nhiều góc cạnh ở thời điểm 48 giờ.

Khi nhuộm giemsa, tế bào bắt màu hồng nhạt, nhân hình trứng và bắt màu kiềm đậm thể hiện tế bào có khả năng phân chia mạnh. Tế bào từ các mẫu mô đều có hình dạng tương tự, không có nhân quái nhân chia.

- Khối tế bào mới tách từ mô mỡ thử nghiệm (50TB/cm²): Số CFU-F tối thiểu là 09, tối đa là 15, tỷ lệ %CFU-F là 14,6

- Khối tế bào tính trong 1 gram mô mỡ (8,8x10⁵): Số CFU-F tối thiểu là 4200, tối đa là 5100, tỷ lệ % CFU-F là 14,6

Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào xác định khả năng tạo tập đoàn (colony) của các tế bào phân lập từ mô mỡ. Khả năng tạo colony là một trong những thí nghiệm thể hiện tế bào có khả năng tự đổi mới nhưng vẫn duy trì được tính di truyền của tế bào. Các tế bào đầu dòng sẽ tạo colony, thí nghiệm này đánh giá bằng test CFU-F.

Kết quả cho thấy số lượng tế bào có khả năng sinh tập đoàn của khối tế bào mới tách từ mô mỡ là 7,5% ± 1,8%. Các thế hệ từ P1 - P5 đạt 16,5-18,6% tùy vào thế hệ tế bào thử nghiệm.



A



B

Hình 9. Tế bào gốc mỡ tạo colony – ngày thứ 1 và 5. (50X)

- (A ) Ngày thứ nhất, tế bào ít và mọc rải rác.

- (B) Ngày thứ 5 đã xuất hiện colony.



A



B

Hình 10. Tế bào gốc mỡ tạo colony ở ngày thứ 10 và 20. (50X)

- (A) Ngày thứ 10, các colony rõ hơn.

- (B) Ngày thứ 20, colony dày và các tế bào hình thoi.

Bảng 3. Khả năng tạo CFU-F theo các thế hệ tế bào (n=5)