Nguyªn lý, mét sè ®iÓm cÇn chó ý khi thùc hiÖn vµ ®äc kÕt qu¶

Nguyªn lý, mét sè ®iÓm cÇn chó ý khi thùc hiÖn vµ ®äc kÕt qu¶

Trong giät m¸u dµy, nhiÒu khi sù dung gi¶i hemoglobin còng lµm chóng ta ph¸t hiÖn sãt ®i mét sè KSTSR, nh­ng còng tuú thuéc vµo xö lý kü thuËt nhuém vµ th«ng th­êng h¹t s¾c tè cßn nguyªn vÑn trªn lam. ViÖc t×m ra KSTSR vµ x¸c ®Þnh chñng lo¹i tuú thuéc vµo kü n¨ng vf tr×nh ®é KTV. Trªn giät dµy cho phÐp t×m KSTSR nhanh h¬n giät máng khi l­îng KST qu¸ Ýt. Quy ®Þnh hiÖn nay r»ng trªn mét lam m¸u nªn lµm 1 giät m¸u dµy vµ 1 giät máng nh»m môc ®Ých hæ trî trong ph¸t hiÖn chñng lo¹i vµ ph¸t hiÖn nhanh ®Ó ®­a ra quyÕt ®Þnh ®iÒu trÞ. Chóng ta nhí r»ng lam giät dµy gåm nhiÒu líp hång cÇu, líp nµy ®Æt trªn líp kia, khi lam giät dµy nhuém víi thuèc nhuém giªm sa, n­íc trong thuèc nhuém sÏ t¸c ®éng lªn hång cÇu tù nã kh«ng thÓ b¶o tån ®­îc. V× hång cÇu kh«ng thÓ b¶o tån ®­îc nªn c¸c chÊt bªn trong nã sÏ hoµ tan trong n­íc. Thµnh phÇn chÝnh cña hång cÇu lµ hemoglobine sÏ bÞ dung gi¶i. HiÖn t­îng nµy x¶y ra khi chóng ta ®Æt lam giät dµy vµo ®Üa hay khay nhuém cã chøa n­íc trong vßng 1-2 phót mµu ®á cña Hb b¾t ®Çu tho¸t ra ngoµi giät dµy vµ ®Ó l¹i giät m¸u nh¹t mµu, tr¾ng ®ôc. TÊt c¶ nh÷ng g× cßn l¹i cuèi giai ®o¹n nhuém ®Òu lµ dÊu vÕt cña hång cÇu, b¹ch cÇu, tiÓu cÇu. V× kh«ng bÞ dµn máng thµnh mét líp duy nhÊt ë trªn lam kÝnh nªn b¹ch cÇu cã vÎ nhá h¬n vµ nguyªn sinh chÊt ®Æc h¬n ë quanh nh©n.

XÐt nghiÖm lam m¸u t×m KSTSR, th­êng gåm c¸c b­íc sau ®©y:

• 
  Giät dµy: tr­íc tiªn huû hemoglobine trong n­íc sau ®ã nhuém Giªm sa
  
• 
  Giät máng: cè ®Þnh cån (dÓ ph©n biÖt chñng lo¹i).
  

§Õm sè l­îng KST trªn 8000 b¹ch cÇu ë giät dµy vµ ë giät máng ®Õm sè KST trªn 1000 hång cÇu hay nhiÒu h¬n tuú mËt ®é cao hay thÊp, sau ®ã nh©n víi sè hång cÇu/ L chia cho 1000; hoÆc tÝnh ­íc l­îng theo nhiÒu b¶ng tÝnh sau:

1-10 KST/100 vi tr­êng giät dµy: (+)

11-100 KST/ 100 vi tr­êng giät dµy (++)

1-10 KST/1 vi tr­êng giät dµy (+++)

> 10 /1 vi tr­êng giät dµy (++++)

Song c¸ch ®¸nh gi¸ trªn chØ mang tÝnh ­íc l­îng chø kh«ng nãi lªn møc ®é trÇm träng trong mét sè tr­êng hîp; ch¼ng h¹n nÕu bÖnh nh©n cã 5000 KSTSR/ L lµ chóng ta ®¸nh gi¸ (++++) nh­ng nÕu M§KSTSR > 40.000 KST/ L còng ®¸nh gi¸ lµ (++++), khi ®ã kh«ng thÓ nãi lªn tiªn l­îng cho bÖnh nh©n (v× trªn thùc tÕ l©m sµng th× mËt ®é KSTSR cao ®­îc xem lµ mét tiªu chuÈn chÈn ®o¸n sèt rÐt nÆng hoÆc sèt rÐt ¸c tÝnh).

Quy tr×nh kü thuËt

1. 
   ChuÈn bÞ lam m¸u: lam m¸u ph¶i lÊy lam s¹ch cã kÝch th­íc 25 x 75mm, kh«ng dÝnh mì. M¸u ®­îc lÊy ë ®Çu ngãn tay hoÆc d¸i tai, hoÆc ngãn c¸i bµn ch©n hay ë gãt ch©n trÎ em,... Da ®­îc lau s¹ch b»ng cån vµ ®Ó kh« tr­íc khi lÊy m¸u b»ng kim chÝch m¸u chuyªn dïng (vÒ mÆt an toµn sinh häc kim nµy chØ dïng mét lÇn), lÊy mét giät m¸u sau khi ®· bá giät m¸u ®Çu.
   
2. 
   Ghi m·: C¸c lam m¸u ®Òu ®­îc ghi tªn hoÆc m· sè phï hîp víi phiÕu xÐt nghiÖm kÌm theo. HiÖn nay th­êng nhuém giªm sa hoÆc Leishman, hoÆc ph­¬ng ph¸p nhuém Field. Nh­ng th«ng dông nhÊt vÉn lµ nhuém giªm sa.
   

• 
  Ph­¬ng ph¸p nhuém Giªm sa:
  

• 
  Giät m¸u dµy: sau khi m¸u ®Çu ngãn tay nhá xuèng lam kÝnh ®é 2,3 giät ®ñ kÝch th­íc giät m¸u 1,5cm ®­êng kÝnh (cã thÓ ®¸nh giät m¸u b»ng mét gãc lam cña mét lam kh¸c, nh­ng còng cã t¸c gi¶ kh«ng cÇn ®¸nh m¸u). §Ó kh« tù nhiªn tr¸nh bôi vµ c¸c c«n trïng kh¸c v©y bÈn
  

• 
  Giät m¸u máng: nhá giät m¸u nhá vµo ®Çu lam vµ dïng mét c¹nh lam kh¸c kÐo m¸u ®i víi mét gãc 45⁰. §Ó m¸u kh« tù nhiªn vµ cè ®Þnh b»ng cån nguyªn chÊt. Chó ý ®éng t¸c dµn m¸u ph¶i ®Òu ®Æn kh«ng nhanh qu¸ (lµm giät m¸u ®µn qu¸ máng vµ tíi s¸t cùc d­íi lam), kh«ng chËm qu¸ (giät ®µn sÏ ng¾n vµ dµy).
  

3. 
   C¸ch pha c¸c dung dÞch nhuém:
   

• 
  Giªm sa bét (Azure B type) 3,8g
  
• 
  Glycerol tinh khiÕt 250 ml
  
• 
  Methyl alcohol tuyÖt ®èi 250 ml
  

* Pha thuèc nhuém giªm sa: cho dung dÞch ®Öm pha vµo dung dÞch mÑ mçi ®ît nhuém lam ®­îc pha chÕ theo c«ng thøc sau

• 
  Potasium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ 0,7 g
  
• 
  Disodium hydrogen phosphate Na₂HPO₄ 1,0g
  
• 
  N­íc cÊt (DW /ED) 1000 ml
  

4. 
   Kü thuËt nhuém lam m¸u
   

• 
  Giät máng
  

1. 
   Giät m¸u máng (giät ®µn) cè ®Þnh b»ng cån methylique tuyÖt ®èi trong 30 gi©y.
   
2. 
   Dung dÞch nhuém míi pha (5ml dung dÞch giªm sa mÑ cho vµo 100ml dung dÞch ®Öm) 5%.
   
3. 
   Nhá lªn lam m¸u dÞch nhuém Giªm sa, thêi gian nhuém dÓ 30 phót (chuÈn)
   
4. 
   Röa thuèc nhuém b»ng n­íc s¹ch nhÑ nhµng vµ ®Ó kh« lam.
   

• 
  Giät dµy
  

1. 
   Giät m¸u dµy ®Ó kh« (kh«ng ®­îc h¬ nãng), tèt nhÊt lµ ®Ó 24 giê trong nhiÖt ®é phßng, ë 37⁰C còng ph¶i ®Ó tèi ®a 2 giê th× míi ®¶m b¶o chÊt l­îng lam.
   
2. 
   Pha 3-5 ml dung dÞch Giªm sa mÑ cho vµo 100 ml dd ®Öm pha s½n
   
3. 
   Nhá thuèc nhuém phñ kÝn giät m¸u dµy trong 30 phót.
   
4. 
   Röa lam nhÑ nhµng (tr¸nh bong giät m¸u) b»ng n­íc s¹ch.
   
5. 
   §Ó kh« lam sau nhuém, kh«ng h¬ nãng.
   

Khi sö dông vËt kÝnh dÇu lµ khi soi, chóng ta nhá mét giät dÇu lªn tiªu b¶n tr­íc khi quan s¸t. DÇu soi ph¶i lµ dÇu soi chuyªn dông (immersion oil), th­êng dïng lo¹i dÇu b¹ch h­¬ng hay dÇu anisole v× dÇu anisole bèc h¬i khái tiªu b¶n sau mét thêi gian, ®iÒu nµy cã nghia lµ sau khi soi kh«ng cÇn ph¶i lau s¹ch dÇu vµ nh­ vËy Ýt cã kh¶ n¨ng lµm x­íc hoÆc trãc, thËm chÝ chïi mÊt mÉu m¸u

T¹i nh÷ng phßng thÝ nghiÖm dïng dÇu soi mua ë thÞ tr­êng, cÇn thiÕt ph¶i lau thÊu kÝnh cña vËt kÝnh sau khi ®· kÕt thóc c«ng viÖc b»ng v¶i mÒm cã tÈm xylene.

C¸c c¸ch tiÕn hµnh khi dïng vËt kÝnh dÇu

1. 
   §iÒu chØnh ®é chiÕu s¸ng.
   
2. 
   Dïng hÖ thèng ®iÒu chØnh th« (èc vÜ cÊp) ®Ó ®­a cao èng kÝnh lªn.
   
3. 
   Khi ®· ®ñ kho¶ng c¸ch gi÷a m©m kÝnh vµ vËt kÝnh x100, quay l¹i m©m vËt kÝnh ®Ó cho vËt kÝnh ë bªn trªn tiªu b¶n.
   
4. 
   Nhá 1-2 giät dÇu soi lªn tiªu b¶n ë diÖn ®Þnh xÐt nghiÖm.
   
5. 
   Dïng hÖ thèng ®iÒu chØnh th« h¹ thÊp mét c¸ch cÈn thËn vËt kÝnh cho ®Õn khi thÊu kÝnh tiÕp xóc víi dÇu soi. Khi ®ã n©ng nhÑ nhµng thÊu kÝnh lªn sao cho thÊu kÝnh vµ dÇu vÉn cßn dÝnh nhau.
   
6. 
   Dïng hÖ thèng ®iÒu chØnh tinh (èc vi cÊp) dÓ ®Æt tiªu b¶n vµo ®óng tiªu cù vµ ®iÒu chØnh ®é chiÕu s¸ng b»ng c¸ch ®iÒu chØnh mµn ch¾n s¸ng.
   

Kü thuËt giät m¸u dµy do Ronald Ross ®Ò ra n¨m 1903 tËp trung ®­îc 20-30 líp hång cÇu trªn mét diÖn tÝch nhá, cho phÐp ta ph¸t hiÖn nhanh KSTSR.

• 
  Ph­¬ng ph¸p nhuém Field (giät dµy)
  

1. 
   Lam m¸u ®em nhóng vµo thuèc nhuém A trong vßng 5 gi©y (xanh methylÌne).
   
2. 
   Röa s¹ch nhÑ nhµng d­íi vßi n­íc s¹ch trong 5 gi©y, cho ®Õn khi cÇm lam kÝnh lªn thÊy trong veo lµ ®¹t hiÖu qu¶.
   
3. 
   LÊy lam m¸u ra vµ nhóng tiÕp tôc vµo thuèc nhuém B (dung dÞch eosine), chó ý nhóng thËt nhanh vµ rót lam m¸u ra thËt nhanh.
   
4. 
   Röa lam thËt thanh trong vßng 5 gi©y d­íi vßi n­íc vµ ®Ó kh« lam.
   

• 
  Ph­¬ng ph¸p nhuém Wright (giät máng)
  

1. 
   Phñ lªn lam m¸u lo¹i dung dÞch gèc (stock) trong 1,5- 2 phót.
   
2. 
   Thªm mét l­îng t­¬ng ®­¬ng n­íc cÊt s¹ch hoÆc dung dÞch buffer (pH 7,2). Nhuém trong 3 phót, khi ®æ dung dÞch lªn kh«ng cho ®æ ra ngoµi lam.
   
3. 
   Röa b»ng n­íc cÊt hoÆc dung dÞch ®Öm, sau ®ã ®Ó kh« tù nhiªn.
   

M¸u khi lÊy trùc tiÕp tõ tÜnh m¹ch vµo mét èng nghiÖm lµ mét chÊt láng mµu ®á. NÕu ®Ó èng nghiÖm trong t­ thÕ ®øng tõ 15-20 phót, chóng ta thÊy m¸u t¸ch ra 2 líp kh¸c nhau: líp huyÕt thanh (líp chÊt láng mµu vµng nh¹t) vµ huyÕt t­¬ng côc m¸u lµ mét chÊt cã ®é ch¾c võa ph¶i, cã mµu sÉm h¬i ®en, nã chøa hång cÇu, b¹ch cÇu, tiÓu cÇu.

1. 
   Trªn giät m¸u máng: lµ chóng ta ®Õm sè l­îng KSTSR trung b×nh trªn 1000 hång cÇu (chó ý r»ng mét vi tr­êng cã 200-250 hång cÇu). Tõ kÕt qu¶ tÝnh ®­îc, chóng ta cã thÓ quy ra tû lÖ phÇn tr¨m nhiÔm cña bÖnh nh©n.
   
2. 
   Trªn giät m¸u dµy:
   

Sè l­îng KSTSR ®Õm ®­îc x 8000

Sè l­îng b¹ch cÇu ®Õm ®­îc

Cã mét sè lçi th«ng th­êng ®èi víi c¸c lam m¸u vµ c¬ thÓ ng­êi bÖnh g©y nhÇm lÉn ®Õn viÖc ®¸nh dÊu nhuém hay xÐt nghiÖm vµ ®äc kÕt qu¶.

1. 
   §Æt vÞ trÝ cña giät m¸u: ph¶i nh×n xem n¬i nµo ®Ó ®Æt giät m¸u cho ®óng trªn lam kÝnh. NÕu ®Æt kh«ng ®óng, cã thÓ g©y khã kh¨n trong xÐt nghiÖm lam giät dµy. Trong khi nhuém hay trong qu¸ tr×nh ®Ó kh«, cã thÓ giät m¸u mét phÇn bÞ chµ s¸t.
   
2. 
   Qu¸ nhiÒu m¸u trªn lam kÝnh: sau khi nhuém th× giät dµy sÏ bÞ xanh qu¸, sÏ cã nhiÒu b¹ch cÇu ë giät m¸u dµy vµ nh÷ng BC nµy sÏ lµm tèi hay che lÊp KSTSR nÕu cã. Lam giät máng qu¸ dµy khã xÐt nghiÖm sau khi cè ®Þnh.
   

3. 
   M¸u dµn trªn lam kÝnh cã dÝnh mì: giät m¸u bÞ dµn ra kh«ng ®Òu nªn khã soi, cã thÓ ngay c¶ giät dµy còng bÞ bong ra trong qu¸ tr×nh nhuém.
   
4. 
   Bê cña lam kÝnh dµn ra bÞ mÎ: khi bê cña lam kÝnh dµn m¸u bÞ mÎ, giät máng khi dµn ra sÏ cã nhiÒu v¹ch vµ nhiÒu ®u«i. ViÖc ®¸nh lam giät dµy còng bÞ háng.
   

• 
  Ruåi, d¸n, kiÕn cã thÓ ¨n m¸u kh« vµ lµm tæn h¹i ®Õn c¸c giät m¸u.
  
• 
  Giät m¸u ®­îc lµm trªn nh÷ng lam kÝnh bÞ x­íc nhiÒu.
  
• 
  Giät dµy kh« kh«ng ®Òu.
  
• 
  Cè ®Þnh c¸c giät dµy b»ng søc nãng hay ®Ó kh« kh«ng ®ñ thêi gian & nh­ thÕ nhuém sÏ khã kh«ng ®¹t yªu cÇu.
  
• 
  C¸c lam m¸u ®ãng gãi cïng nhau tr­íc khi c¸c giät dµy ®­îc kh« thËt sù vµ c¸c tiªu b¶n sÏ dÝnh nhau
  

Chóng ta cã thÓ mét vµi lÇn nh×n thÊy 1-2 vËt gi¶ trong nh÷ng lam m¸u mµ g©y ra sù nhÇm lÉn víi h×nh ¶nh cña KSTSR . C©u hái ®Æt ra: “ liÖu ®©y lµ KSTSR hay kh«ng” khiÕn chóng ta ®­a ra kÕt qu¶ cho ng­êi thÊy thuèc l©m sµng ®iÒu trÞ kÞp thêi ch¨ng.

NÕu chóng kh«ng ph¶i lµ KSTSR th× chóng lµ c¸i g×, thµnh phÇn cña m¸u ch¨ng? §©y lµ c©u hái khã tr¶ lêi ngay. Chóng cã thÓ lµ nÊm ph¸t triÓn trªn nh÷ng giät m¸u nªn chóng ta ph¶i tr¸nh nhÇm lÉn b»ng c¸ch nhuém lam m¸u cµng sím cµng tèt sau khi lÊy m¸u vµ ®Ó kh«, trong vßng 48 giê lµ chËm nhÊt. DÜ nhiªn, ®iÒu nµy kh«ng ph¶i lóc nµo còng thùc hiÖn ®­îc.

Mét sè h×nh gi¶ bay trong kh«ng khÝ vµ ®­îc giã ®­a ®i, chóng dÝnh trªn lam m¸u trong qu¸ tr×nh m¸u kh« tr­íc khi nhuém hay sau khi nhuém vµ trong khi ®Ó kh« m¸u ®· nhuém. Mét sè kh¸c coi nh­ lµ chÊt lµm nhiÔm bÈn giät m¸u: cã lÏ chóng ta kh«ng lau s¹ch tay tr­íc khi lÊy m¸u, ngay c¶ lam m¸u còng lµ nguyªn nh©n cña vÊn ®Ò.

Trong khi kh«ng h¼n lµ mét h×nh gi¶ mµ chóng ta v« t×nh thÊy Êu trïng cña Wuchereria bancrofti hay cña loµi kh¸c. H×nh d¹ng cong mÒm m¹i vµ ®­îc x¸c ®Þnh râ khi nhuém giªm sa.

Ch¼ng h¹n:

• 
  TÕ bµo l­íi vµ m¶nh chromatide, c¸c nhãm riªng rÏ hång cÇu non (ch­a tr­ëng thµnh) trong thiÕu m¸u nÆng, cÊc tinh thÓ cña thuèc nhuém giªm sa, c¸c m¶nh vôn.
  
• 
  TiÓu cÇu vµ tÕ bµo vµ c¸c h¹t toan tÝnh, c¸c vÕt x­íc kiÓu tr­ît trªn lam kÝnh.
  
• 
  TÕ bµo thùc vËt (vegetable cells), nh÷ng lç chç thuû tinh trªn lam kÝnh mê.
  
• 
  Bµo nang nÊm (hyphae and spores fungus).
  

2. 
   Kü thuËt QBC^ (Quantitative Buffy Coat) test