Ph­¬ng ph¸p ChÈn ®o¸n bÖnh sèt rÐt Tõ chuÈn vµng giemsa ®Õn ph¶n øng chuçi trïng hîp



tải về 288.97 Kb.
trang3/7
Chuyển đổi dữ liệu03.10.2016
Kích288.97 Kb.
#32598
1   2   3   4   5   6   7

Giíi thiÖu


Kü thuËt QBC (Quantitative Buffy Coat) ®­îc giíi thiÖu lÇn ®Çu tiªn n¨m 1983 bëi 2 t¸c gi¶ Wardlaw vµ Levine. Sau ®ã h·ng Becton Dickinson cho ra ®êi c¸c thiÕt bÞ chuyªn dông cho kü thuËt nµy. KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy ph­¬ng ph¸p cã ®é nh¹y cao so víi ph­¬ng ph¸p nhuém giªm sa th­êng quy. V× nhuém hång cÇu cã KST b»ng acridine, quay ly t©m ®Ó tËp trung KSTSR, råi xem d­íi huúnh quang. Kü thuËt nµy dïng trong tr­êng hîp cÇn x¸c ®Þnh c¨n nguyªn nh­ng KSTSR qu¸ Ýt, kh«ng thÓ ph¸t hiÖn ®­îc b»ng ph­¬ng ph¸p th­êng quy. §iÓm ®¸ng chó ý r»ng kü thuËt QBC kh«ng cho phÐp ®Þnh l­îng.

Nguyªn lý


  • Kü thuËt QBC dùa trªn nguyªn lý b¾t mµu AO cña DNA hay RNA cña KSTSR d­íi KHV huúnh quang. Nh©n sÏ ph¸t mµu xanh l¸ c©y vµ bµo t­¬ng b¾t mµu ®á tÝm.

  • Nhuém Acridine mµu da cam líp hång cÇu ly t©m vµ sö dông nguån s¸ng tia cùc tÝm (UV).

  • L­îng m¸u lÊy tõ bÖnh nh©n kho¶ng 55-56 L, chøa trong èng huyÕt cÇu tè cã s½n thuèc nhuém acridine orange (AO) vµ posstasium oxalate, sau ®ã ®em quay ly t©m 12.000 vßng/ phót (12.000 rpm) trong 5 phót.

  • Thµnh phÇn líp tÕ bµo m¸u ®­îc ph©n líp tuú thuéc tû träng, t¹o thµnh c¸c d¶i KST chøa DNA b¾t mµu thuèc nhuém xuÊt hiÖn d­íi luång s¸ng UV (ng­ìng ph¸t hiÖn KST n»m ë giao diÖn hång cÇu/ b¹ch cÇu).

KÕt qu¶


  • Trong mét nghiªn cøu, Craig vµ Sharp (1997) cho thÊy ng­ìng ph¸t hiÖn cña kü thuËt lµ 84KST/L, ®é nh¹y 89,75%, ®é ®Æc hiÖu trªn 95%. §é nh¹y cña test cã thÓ t­¬ng ®­¬ng hoÆc h¬n giät m¸u dµy theo ph­¬ng ph¸p nhuém Giªm sa.

  • §é ®Æc hiÖu cã thÓ nh×n nhËn d­¬ng tÝnh gi¶ nÕu kü thuËt viªn ch­a ®ñ tr×nh ®é soi. §èi chiÕu tû lÖ d­¬ng tÝnh gi¶ QBC lµ 25% vµ nhuém Giªm sa lµ 18%.

  • Ph­¬ng ph¸p nµy cho kÕt qu¶ nhanh h¬n giªm sa, song ®ßi hái KTV ph¶i kinh nghiÖm thùc hµnh th­êng xuyªn, trang bÞ cÇn thiÕt ngoµi KHV cÇn cã ®ñ ph­¬ng tiÖn kh¸c. Mét nh­îc ®iÓm cña test nµy lµ gi¸ thµnh rÊt ®¾t.

  1. Ph­¬ng ph¸p nhuém AO cña t¸c gi¶ Kawamoto

Giíi thiÖu


Ph­¬ng ph¸p nhuém AO (Acridine Orange) còng nh­ QBC ®Òu lµ nh÷ng ph­¬ng ph¸p c¶i tiÕn cña ph­¬ng ph¸p nhuém giªm sa th«ng th­êng (mét sè t¸c gi¶ gäi lµ Ðdition modifiÐ du giemsa). Nã gióp chÈn ®o¸n nhanh KSTSR trªn lam m¸u giät dµy vµ giät máng. KHV dïng trong ph­¬ng ph¸p nµy lµ KHV ¸nh s¸ng th­êng cã g¾n thªm bé phËn läc (filter kit) ®Æc biÖt bªn ngoµi kÝnh cho nhuém mµu huúnh quang AO ë m©m kÝnh vµ thÞ kÝnh. Nh©n KSTSR cho mµu xanh l¸ c©y vµ t­¬ng bµo b¾t mµu ®á.

Ph­¬ng ph¸p AO dÓ thùc hiÖn, KTV cã thÓ Ýt kinh nghiÖm còng ph¸t hiÖn ®­îc, tiÕt kiÖm ®­îc thêi gian; khi so s¸nh víi ph­¬ng ph¸p giªm sa r»ng ®é nh¹y trªn lam giät máng lµ 96,4%, ®é ®Æc hiÖu lµ 95,1%. Nh÷ng tr­êng hîp mËt ®é KSTSR <5000/L, ®é nh¹y cña ph­¬ng ph¸p AO cao h¬n nhiÒu so víi lam giät máng nhuém giªm sa.


Quy tr×nh kü thuËt


  • Trang bÞ vµ vËt liÖu: kÝnh hiÓn vi cã kÌm kÝnh läc ®Æc biÖt vµ nguån s¸ng cña ®Ìn halogen, thuèc nhuém AO, bé dông cô xÐt nghiÑm m¸u th«ng th­êng.

  • Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh:

  • B­íc 1: lµm tiªu b¶n giät ®µn gièng kü thuËt giªm sa, chê tiªu b¶n kh« tù nhiªn, cè ®Þnh tiªu b¶n b»ng cån 900.

  • B­íc 2: lÊy mét lamen, nhá mçi gãc lamen mét giät dung dÞch AO

  • B­íc 3: dïng ngãn tay c¸i vµ ngãn tay trá nhÑ nhµng ®Æt óp lamne vµo phÇn ®u«i cña giät m¸u (n¬i mµ KSTSR t­¬ng ®èi tËp trung vµ cã h×nh thÓ râ), ph¶i chó ý ®Ó lamen song song víi mÆt ph¼ng cña tiªu b¶n.

  • B­íc 4: dïng ®Çu ngãn tay Ên nh¹ trªn lamen, ®Ó tÊm lamen sao cho tiÕp xóc víi mÆt ph¼ng cña lam s¸t nhÊt, nÕu kh«ng kho¶ng c¸ch gi÷a lamen vµ lam kÝnh lín khi soi sÏ thÊy c¸c vËt thÓ tr«i ch¶y (kh«ng cè ®Þnh), ®iÒu nµy dÉn ®Õn kh«ng thÓ thÊy KSTSR ®­îc. Tiªu b¶n ®¹t kû thuËt khi kh«ng cã bät khÝ trong dung dÞch AO khi soi c¸c vËt thÓ cè ®Þnh.

  • B­íc 5: lo¹i bá dung dÞch AO thõa ë r×a lamen b»ng giÊy thÊm.

  • B­íc 6: tiÕn hµnh ®äc kÕt qu¶ trªn KHV b»ng vËt kÝnh 40x (chó ý ®Æt 2 miÕng plastic läc vµo m©m vËt kÝnh vµ ®iÒu chØnh ®Ó cã mµu phï hîp nhÊt), h×nh ¶nh KSTSR còng ph¸t s¸ng d­íi ¸nh s¸ng huúnh quang t­¬ng tù nh­ ë kü thuËt QBC

¦u vµ nh­îc ®iÓm kü thuËt AO

Ph­¬ng ph¸p nµy cã ®é nh¹y vµ ®é chÝnh x¸c cao, thêi gian xÐt nghiÖm kho¶ng 10 phót, ph­¬ng tiÖn ®¬n gi¶n, rÎ tiÒn h¬n so víi thö nghiÖm QBC vµ cã thÓ ¸p dông ë mét sè tuyÕn, nhÊt lµ c¸c viÖn vµ trung t©m, bÖnh viÖn chuyªn khoa. Song, kü thuËt nµy khã ®Þnh lo¹i KSTSR vµ phô thuéc vµo kiÕn thøc còng nh­ kinh nghiÖm XNV, ngoµi ra ph­¬ng ph¸p nµy ®ßi hái XNV cÇn cã kiÕn thøc chung vÒ h×nh th¸i KSTSR khi soi ë lam nhuém giªm sa th­êng quy.



  1. C¸c ph­¬ng ph¸p chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc (Serological test)

C¸c thö nghiÖm nµy cã gi¸ trÞ h¹n chÕ trong C§SR v× kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh chØ cã ý nghÜa r»ng c¬ thÓ xuÊt hiÖn kh¸ng thÓ chèng sèt rÐt tån t¹i trong m¸u. Nh­ng mét ®iÓm lîi lµ chóng cã ý nghÜa trong c¸c nghiªn c­ó ®iÒu tra dÞch tÔ häc, nh­ ®¸nh gi¸ l­u hµnh ®iÓm cña bÖnh, ®¸nh gi¸ xu h­íng bÖnh lan truyÒn hay kh«ng?, ph¸t hiÖn c¸c æ bÖnh sau ®ît thanh to¸n. Ngoµi ra, c¸c thö nghiÖm nµy cßn øng dông trong chÈn ®o¸n c¸c tr­êng hîp nghi ngê héi chøng l¸ch to nhiÖt ®íi, sµng läc m¸u trong c¸c ng©n hµng m¸u, m«, t¹ng.

§Õn nay, nhiÒu ph­¬ng ph¸p thö nghiÖm huyÕt thanh häc ®· ®­îc triÓn khai nh­ miÔn dÞch kÕt tña (IP- Immunoprecipitation techniques), miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp (IFA-Indirect fluorescent antibody), ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu gi¸n tiÕp (IHA- Indirect hemaaglutination assay), miÔn dÞch hÊp thô liªn kÕt men (ELISA- Enzyme linked Immunosorbent assay), miÔn dÞch phãng x¹, kü thuËt øc chÕ tiÓu thÓ hoa cóc trong nu«i cÊy, thö nghiÖm khuyÕch t¸n kÐp (DDT- Double gel diffusion test),.... c¸c ph­¬ng ph¸p nµy kh¸c nhau vÒ nguån kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ ®Ých còng nh­ ph¹m vi øng dông.



  1. Ph­¬ng ph¸p sö dông vËt dß DNA (DNA probes)

Kü thuËt lai t¹o dïng vËt dß DNA rÊt nh¹y vµ cã thÓ ph¸t hiÖn t¸c nh©n g©y bÖnh ë ng­ìng 50KST/L m¸u. Ph­¬ng ph¸p nµy cã ®é nh¹y lín h¬n so víi ph­¬ng ph¸p nhuém giªm sa, mÆc dï mét KTV kinh nghiÖm cã thÓ ph¸t hiÖn KST ë ng­ìng 20 KST/L trªn lam giät dµy. tuy nhiªn; ph­¬ng ph¸p vËt dß DNA kh«ng thÓ ph¸t hiÖn ®­îc tÊt c¶ c¸c tr­êng hîp mµ kü thuËt giªm sa cã thÓ, ®Æc biÖt nhiÔm P.vivax, bëi v× ®é nh¹y cña ph­¬ng ph¸p trong nh÷ng tr­êng hîp nµy kÐm gÊp 10 lÇn khi nhiÔm P.falciparum.

ChÈn ®o¸n sèt rÐt dïng vËt dß DNA ®­îc øng dông trong c¸c nghiªn cøu vÒ dÞch tÔ v× kü thuËt nµy cã thÓ ®­îc ®¬n gi¶n ho¸ b»ng c¸ch nhá mét Ýt m¸u trªn giÊy thÊm nitrocellulose. Mét KTV cã thÓ thùc hiÖn ®­îc 1000 mÉu m¸u/ ngµy; trong khi ®ã, víi ph­¬ng ph¸p giªm sa, mçi ngµy chØ cã thÓ xÐt nghiÖm kho¶ng 60 lam. Nh­ vËy, ­u ®iÓm cña kü thuËt vËt dß DNA lµ cã thÓ tiÕn hµnh víi mét l­îng lín mÉu trong mét thêi gian ng¾n. Mét h¹n chÕ cña kü thuËt lµ phô thuéc rÊt lín vµo sè l­îng b¶n sao cña chuçi ®Ých ë KSTSR còng nh­ vµo ®é nh¹y cña ph­¬ng ph¸p ®­îc dïng ®Ó ph¸t hiÖn s¶n phÈm lai.



  1. Ph¶n øng chuçi trïng hîp (PCR-polymerase chain reaction)

PCR hay cßn gäi lµ hÖ thèng khuyÕch ®¹i b¶n sao (transcript amplification system) hoÆc ph¶n øng trïng hîp nhê men DNA polymerase. Lµ mét kü thuËt in vitro, gãp phÇn kh¾c phôc nh­îc ®iÓm cña kü thuËt vËt dß DNA. VÒ mÆt ho¸ sinh, c¸c acide nucleic ®Ých, qua kü thuËt PCR sÏ ®­îc khuyÕch ®¹i lªn nhiÒu lÇn trong mét thêi gian t­¬ng ®èi ng¾n, lµm t¨ng ®é chÝnh x¸c trong chÈn ®o¸n cña c¸c kü thuËt lai b»ng vËt dß DNA. ¦u ®iÓm quan träng cña kü thuËt PCR lµ chØ cÇn mét l­îng rÊt nhá DNA ®Ých hay DNA khu«n mÉu. D­íi xóc t¸c mét lo¹i enzyme bÒn víi nhiÖt, qóa tr×nh tæng hîp c¸c DNA míi ®­îc b¾t ®Çu b»ng sù kÕt g¾n cña chÊt måi (primer) vµo c¸c vÞ trÝ trªn DNA khu«n mÉu (chÊt måi lµ mét chuçi DNA ng¾n, cã tr×nh tù theo thø tù nguyªn t¾c bæ sung víi m¹ch gèc, sÏ ch¹y dÇn theo chiÒu 5’  3’).

Kü thuËt PCR th­êng ®­îc dïng trong nghiªn c­ó dÞch tÔ, nhËn ®Þnh chñng kh¸ng thuèc, x¸c ®Þnh ®ét biÕn ®iÓm kh¸ng thuèc (vÝ dô fansidar), chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh c¸c lo¹i KSTSR, song nay Ýt ¸p dông cho viÖc chÈn ®o¸n chñng lo¹i v× nhËn thÊy kh«ng nªn so s¸nh víi chuÈn vµng (gold standard), chÈn ®o¸n ph©n biÖt tr­êng hîp t¸i ph¸t (relapse) hay t¸i nhiÔm (re-infection) nghÜa lµ khi bÖnh nh©n ®· hoµn tÊt mét liÖu tr×nh ®iÒu trÞ ®óng mµ xuÊt hiÖn l¹i KSTSR, x¸c ®Þnh kiÓu gen mét chñng KSTSR l¹, x¸c ®Þnh KSTSR ë trung gian truyÒn bÖnh. Kü thuËt nµy lµ mét thay thÕ cã hiÖu qu¶ cho ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro trong ®¸nh gi¸ kh¸ng thuèc; ®Æc biÖt víi chñng P.vivax, khi mµ kh¶ n¨ng nu«i cÊy dµi ngµy trong phßng thÝ nghiÖm kh«ng thµnh c«ng, vµ ®¸nh gi¸ tÝnh nh¹y c¶m thuèc ®Õn nay vÉn cßn dùa chñ yÕu vµo ®¸p øng l©m sµngvµ x¸c ®Þnh nång ®é thuèc trong huyÕt thanh theo ph­¬ng ph¸p liÒu chuÈn víi chloroquine (tiªu chuÈn Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi).

Ph­¬ng ph¸p nµo dï cã hiÖn ®¹i ®Õn ®©u còng kh«ng tr¸nh khái nh­îc ®iÓm. Kü thuËt PCR còng vËy, nÕu chóng ta cho ch¹y qu¸ nghiÒu chu kú trong khi s¶n phÈm cña ph¶n øng cho võa ®ñ th× liÖu cã ra c¸c b¶n sao tiÕp theo hay kh«ng, hoÆc khi ch¹y ®iÖn di th× c¸c band còng cho h×nh ¶nh gÇn gièng nhau, nhÊt lµ khi thang marker cã gi¸ trÞ gÇn t­¬ng ®­¬ng, hoÆc s¶n phÈm thõa trong ph¶n øng hoÆc nÕu chóng ta tinh khiÕt DNA kh«ng s¹ch ®«i khi ph©n tÝch kÕt qu¶ cã sù nhÇm lÉn trªn gel agarose; ngoµi ra, gi¸ thµnh cña mét lÇn xÐt nghiÖm còng rÊt ®¾t (kho¶ng 3-5USD/test), khã chÊp nhËn nÕu dïng ®Ó chÈn ®o¸n bÖnh mét c¸ch th­êng quy.


  1. Ph­¬ng ph¸p ph¸t hiÖn s¾c tè sèt rÐt trong b¹ch cÇu hoÆc ®¹i thùc bµo



tải về 288.97 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4   5   6   7




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương