Ức chế enzyme alpha-glucosidase [44]

1.5. Ức chế enzyme alpha-glucosidase [44]

1.5.1.Enzyme alpha-glucosidase:

Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung ứng lớn chất đường vào cơ thể.  Trước khi các phân tử đường được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể, thì những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym trong ruột non. Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng (pancreas) phải tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid.  Màng tế bào ruột non lại tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hoá các oligosaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu.  Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu.

Phương pháp nghiên cứu ức chế ezym α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường typ 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy… như các phương pháp khác.

Phương pháp nghiên cứu in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của một số hợp chất thiên nhiên dựa trên nguyên tắc:

• 
  Enzym α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucopyranosyl sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose.
  
• 
  Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid, dưới tác dụng của enzym α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol.
  
• 
  p-Nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 400nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.
  
• 
  Khi sử dụng chất ức chế α-glucosidase sẽ làm cho phản ứng của enzym bị ngừng lại, không tạo ra được sản phẩm D-glucose.
  

Măng cụt (Garcinia mangostana L.), họ Bứa (Clusiaceae) là loài cây nhiệt đới ăn quả được. Cây to, cao từ 7 – 25 m, lá dày, dai, màu lục sẫm, hình thuôn dài. Hoa đực cụm 3 – 9 hoa có lá bắc. Hoa lưỡng tính có cuống, có đốt. Quả hình cầu, to trung bình, khi chín có vỏ ngoài dày cứng, màu đỏ tím đậm, trong đỏ tươi như rượu vang, dày xốp, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhụy. Trong quả có từ 6 – 18 hạt, quanh hạt có áo hạt trắng ngà.

Cây măng cụt có nguồn gốc Mã Lai, Nam Dương, từ Malaca qua Moluku. Ngày nay bắt gặp ở Ấn Độ, khắp Đông Nam Á: Myanma, Sri Lanka, Philipines,…Ở Việt Nam, măng cụt được trồng nhiều ở các tỉnh miền Nam: Tây Ninh, Gia Định, Vĩnh Long, Thủ Dầu Một,…nơi đây có khí hậu nóng ẩm nên cây dễ mọc, vì nó không thể tiến lên miên Bắc xứ lạnh, xa nhất là đến Huế [7].

1.6.2. Thành phần hóa học của vỏ quả măng cụt

Vỏ quả măng cụt có thành phần chính là các xanthon, trong đó những chất chính là các mangostin, tươi, không vị, tan trong rượu, ete, chất kiềm, không tan trong nước, nhiệt nóng chảy 175⁰C như: a – mangostin, b – mangostin, g – mangostin, những iso mangostin, nor mangostin, trioxi xanthon, pyrano xanthon, dihydroxi methyl butenyl xanthon. Tannin chiếm 7 – 13%. Một lượng nhỏ các chất: garcinon A, B, C, D, E; mangostin; garcimangoson A, B, C; gartanin; egonol; epicatechin; procyanidin được tìm ra từ măng cụt có nguồn gốc Việt Nam. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất trên phần lớn đã được nghiên cứu nhưng chưa có tài liệu nào nghiên cứu về hoạt tính chống béo phì và đái tháo đường của chúng.

Theo đông y, vỏ quả măng cụt có vị chua, chát, tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng thu liễn, sáp trường, chi huyết, dùng điều trị tiêu chảy, ngộ độc chất ăn, khi bệnh thuyên giảm thì thôi, dùng lâu sinh táo bón. Có tác dụng trị tiểu đường, nước sắc vỏ quả măng cụt chữa lỵ, đau bụng, đi tiêu chảy, bệnh da vàng. Những khảo cứu mới cho biết những tính chất của vỏ quả măng cụt như: chống oxi hóa, ức chế hoạt động sản xuất acid của vi khuẩn Streptococcus muntans GS – 5.

Quả măng cụt Garcinia mangostana, L. thuộc họ Măng cụt (Chisiaceae) được thu mua tại Hà Nội vào tháng 5 năm 2010 đã được Tiến sĩ phân loại Thực vật Trần Văn Ơn thẩm định tên khoa học tại đại học Dược Hà nội. Quả được đem rửa sạch, tách lấy phần vỏ tươi, bảo quản trong ethanol 90⁰.

Chuột nhắt trắng chủng Swiss 4 tuần tuổi có thể trọng 14 – 15 g và thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22 ± 2⁰C với chu kỳ sáng 21 giờ và tối 21 giờ. Các thức ăn béo cao đã được phối trộn theo tài liệu của Srinivasan [41], Bhavana [19] từ thực phẩm Việt Nam có phẩm chất, thành phần chất xác định dinh dưỡng theo tài liệu của Viện dinh dưỡng Quốc gia.

- Dụng cụ: phễu chiết, bình tam giác, ống nghiệm, giấy lọc, phễu lọc, Pipette 5ml, 10ml;Micropipette 100-1000μl …và các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm.

- Thiết bị: máy cô quay chân không, tủ sấy, bếp điện từ, máy phân tích các thành phần lipid và glucose huyết AU 640 (Olympus) – 7213261, sản xuất tại Nhật Bản,…và các thiết bị khác có liên quan.

2.2.2. Hóa chất

- Dung môi tách chiết: ethanol 90⁰, ethanol, điclometan, n-hexan,…

- STZ (streptozotocin) – hóa chất gây đái tháo đường.

- Metformin (Merck) - một loại thuốc chữa béo phì và ĐTĐ.

- Nước muối sinh lý NaCl 0,9%

- Dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G Sigma) (pha trong nước khử ion).

- α-glucosidase (α-Glc) 17% protein, 194 U/mg protein (G0660 Sigma), (pha trong nước khử ion lạnh).

- Đệm phosphate pH = 6.82

- Đệm natri carbonate pH = 9.62

- Cao chiết (pha trong nước khử ion hoặc dung môi hữu cơ thích hợp).

- Nước khử ion.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Xử lý mẫu

Vỏ quả Măng cụt tươi ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 4 tuần. Sau đó, thu dịch chiết lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao ethanol. Cao ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi điclometan, n-hexan và etylacetat thu được các dịch chiết, sau đó cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao chiết tương ứng.

1. 
   2.3.2.1. Định tính flavonoids [16, 24]
   

- Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.

- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.

- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính .

2. 
   2.3.2.2. Định tính tannins
   

- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H₂SO₄. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.

- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.

- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.

3. 
   2.3.2.3. Định tính các polyphenols khác
   

- Phản ứng với FeCl₃: Nhỏ dung dịch FeCl₃ trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.

• 
  Thuốc thử Keller-Killian:
  
  • 
    Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl₃ 5% vào 50ml acid acetic 10%.
    
  • 
    Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl₃ 5% vào 50ml acid sunfuric đặc.
    
    • 
      Phương pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
      

4. 
   2.3.2.5. Định tính alkaloids
   

- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I₂ trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.

- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl₂ và KI trong nước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.

- Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO_3­)₃ và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.

- Cân 10mg mỗi loại cao và hòa loãng trong 1ml ethanol 90%

- Dung dịch Na₂CO₃: 200g Na₂CO₃ + 800ml H₂O đun sôi, thêm một vài tinh thể Na₂CO₃, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.

- Dung dịch axit gallic + 10 ml C₂H₅OH + 90 ml H₂O bảo quản lạnh

- Chuẩn bị 6 bình định mức 100 ml, sau đó cho vào mỗi bình 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml acid gallic chuẩn, sau đó dẫn nước cất tới 100 ml sẽ thu được dung dịch acid gallic các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l. Dựng đường chuẩn axit gallic.

* Tiến hành:

- Cho vào mỗi cuvet định lượng 20l mẫu thử + 1,58ml H₂O + 100l thuốc thử Folin – Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300l Na₂CO₃. Để hỗn hợp dung dịch trong 2h ở 20⁰C rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.

STT Gallic acid (mg/l) OD765nm 1 0 0,009 2 50 0,062 3 100 0,119 4 150 0,168 5 250 0,265 6 500 0,519

y = 0,001x + 0,0218

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng dùng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh được cân từng con, đánh dấu, phân lô ngẫu nhiên trước khi thí nghiệm. Chuột được chia làm 11 lô, mỗi lô gồm 6 con.

• 
  Lô nuôi thường (lô 1): Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW).
  
• 
  Các lô còn lại (lô 2 đến lô 11): Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột, đậu tương, lòng đỏ trứng, lạc, mỡ nước…
  
• 
  Thời gian nuôi chuột theo 2 chế độ ăn là 4 tuần.
  

Sau 4 tuần nuôi, tiến hành cân trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh như: glucose máu, lipid máu gồm Cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL để xác định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ăn.

Sau khi chuột được nuôi béo phì thực nghiệm thành công chúng tôi tiếp tục tiến hành gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ liều thấp. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h, tiêm màng bụng STZ gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình ĐTĐ typ 2 phát triển từ béo phì. Sau đó chuột được tiếp nhận thức ăn bình thường. Sau 2 – 3 ngày chúng tôi tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt.

Sau khi đã tạo được chuột béo phì và chuột ĐTĐ typ 2 chúng tôi tiến hành phân lô chuột thí nghiệm như sau :

Lô 1: Chuột bình thường, uống nước muối sinh lý NaCl 0,9% (lô đối chứng âm)

Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị (lô đối chứng dương)

Lô 3: Chuột béo phì điều trị bằng thuốc Metformin

Lô 4: Chuột béo phì, điều trị bằng cao ethanol

Lô 5: Chuột béo phì, điều trị bằng cao etylacetat

Lô 6: Chuột béo phì, điều trị bằng cao n-hexan

Lô 7: Chuột ĐTĐ typ 2, không điều trị

Lô 8: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng thuốc Metformin

Lô 9: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao ethanol

Lô 10: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao etylacetat

Lô 11: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao n-hexan

Thời gian điều trị bằng các cao phân đoạn dịch chiết ethanol, etylacetat, n-hexan và metformin là 21 ngày.

Xác định LD₅₀ của dịch chiết vỏ quả măng cụt theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm. Chuột bình thường được nhịn đói trước 16h thí nghiệm (phân lô ngẫu nhiên N = 10) và được cho uống theo liều tăng dần từ 5000 đến 8000 mg/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết vỏ quả măng cụt.

1. Dung dịch NaCl 0,9%

2. Metformin (500mg/kg)

3. Cao dịch chiết phân đoạn (2000mg/kg)

4. Streptozotocin (STZ) (110 mg/kg)

5. Thức ăn có hàm lượng béo cao

Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm của Trung tâm Kiểm nghiệm Bắc Giang. Chuột được cho ăn thức ăn tổng hợp, thức ăn có hàm lượng béo cao và uống nước đun sôi để nguội. Các lô chuột được nuôi trong các lồng riêng biệt để tránh lây chéo có thể xảy ra qua đường hô hấp và tiếp xúc. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến, kết quả thí nghiệm. Chuột được cho uống vào các buổi sáng vào giờ nhất định. Thời gian nuôi béo trong 28 ngày và thời gian điều trị trong 21 ngày.

Để thí tiến hành thí nghiệm đạt kết quả như mục tiêu đề ra, chúng tôi theo dõi chặt chẽ các bước thí nghiệm, cụ thể như: Quan sát tình trạng ăn uống, bài tiết, vận động,... Sau 3 ngày cân lại một lần.

Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh để thu máu. Máu được xác định các chỉ số: Glucose Cholesterol, Triglycerid, HDL_C, LDL_C, GOT và GPT. Đây là những chỉ số đáng tin cậy để đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn vỏ quả măng cụt.

Glucose + O₂ glucose oxidase axit gluconic + H₂O₂ (1)

O-Dianisidin + H₂O₂ phức hợp nâu vàng + H₂O (2)

Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang ( = 500nm) tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng.

Triglycerid Glycerol + acid béo

Glycerol + ATP Glycerol–3–phosphate + ADP

Glycerol–3–phosphate +O₂ Dihydroxyacetone phosphate + H₂O₂

H₂O₂ + Aminoantipyrine + 4-chlorophenol Quinonimin + 4HCl + 4H₂O

* Tính kết quả: Đo mật độ quang học Quinonimin ở bước sóng 546 nm rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại.

2.3.5.3. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh

* Nguyên lý: Thuỷ phân Cholesterol este bằng enzyme Cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng Cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng:

Cholesterol este + H₂O Cholesterol + acid béo

Cholesterol + O₂ Cholesterol–3– one + H₂O₂

2H₂O₂ + 4 – aminophenazone + phenol Quinonimin + H₂O