ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên hà quốc dưƠng nghiên cứu tác dụng hạ glucose và lipid máu của dịch chiết vỏ quả MĂng cụT


Kết quả thử hoạt tính α-glucosidase in vitro



tải về 0.5 Mb.
trang3/4
Chuyển đổi dữ liệu19.09.2016
Kích0.5 Mb.
#32142
1   2   3   4

2.3.5.4. Kết quả thử hoạt tính α-glucosidase in vitro

* Nguyên tắc:


Chúng ta biết rằng, α-glucosidase được tiết ra từ ruột non giúp chuyển hóa các phân tử đường oligosacaride thành những phân tử glucose. Do đó, để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase bằng cách sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) như là cơ chất ban đầu và bị α-glucosidase thủy phân sinh ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP). Dựa vào lượng p-nitrophenol sinh ra, tiến hành đo quang tại bước sóng 400nm.

1 unit (hay 1 U) của enzym α-glucosidase được định nghĩa như là lượng enzym giải phóng 1.0 μmol của PNP-G tại điều kiện phân tích xác định.




α-glucosidase

p-nitrophenol

α-D-glucose

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

(PNP-G)

Khi mẫu có chất hoạt tính ức chế α-glucosidase (chẳng hạn dịch chiết thực vật) thì hàm lượng của p-nitrophenol tạo thành sẽ giảm. Hàm lượng p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc quang hấp thu tại bước sóng là 400nm.

Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở bước sóng 400nm để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50 (là nồng độ ức chế 50%).



Cách tính IC50

    • Khả năng ức chế α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I %). Phần trăm ức chế (I %) được xác định theo công thức:


Ao - As

Với:


Ao: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất ức chế.

As: Giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu có hoạt chất ức chế.



  • IC50 được định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzym α-glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất. Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Từ giá trị I%, ta tính được giá trị IC50

­ Phương pháp tiến hành

  • Trộn lẫn các dung dịch gồm: đệm pH = 6.8, enzym α-glucosidase, chất ức chế với thể tích đã định trước. Tiến hành ống nghiệm đối chứng: đệm pH = 6.8, enzym và dung dịch mẫu trắng cùng thể tích, không chứa chất ức chế.

  • Hoạt hóa hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phút.

  • Thêm cơ chất PNP-G, duy trì phản ứng ở 370C, lắc đều, trong thời gian 20 phút.

  • Kết thúc phản ứng bằng đệm pH = 9.6

  • Đo độ hấp thu A ở λ = 400nm, từ đó xác định % ức chế (%I) và suy ra chỉ số IC50

Chuẩn bị mẫu thử:

- Điều kiện phản ứng: T = 370C, pH = 6.8, nồng độ enzym 0.031U/ml, nồng độ cơ chất PNP-G 0.085mM.

- Chuẩn bị các mẫu ức chế có nồng độ 2.95mg/ml tương ứng với nồng độ 100μg/ml trong hỗn hợp phản ứng. Pha loãng để có các nồng độ 75, 50, 25, 5 μg/ml. Thực hiện đối với mỗi nồng độ (Ci) của từng mẫu thử theo bảng sau:

Bảng 3 : Quy trình của một mẫu thử hoạt tính


CÁC CHẤT

THỂ TÍCH (ml)

Mẫu trắng

Mẫu ức chế

Mẫu không ức chế

Nước khử ion

0.2

0

0.2

Đệm phosphate pH=6.82

5.0

5.0

5.0

Enzym

0

0.2

0.2

Chất ức chế có nồng độ Ci

(dịch chiết thực vật)



0.2

0.2

0

Ủ ở 370C trong 30 phút

PNP-G

0.5

0.5

0.5

Lắc đều, ủ ở 370C trong 20 phút

Lấy 2ml mỗi hỗn hợp cho vào ống nghiệm có sẵn 8ml đệm pH = 9.62, lắc đều

Đo độ hấp thu ở 400nm trên máy quang phổ UV-Vis và tính theo công thức I (%)


2.3.6. Xác suất thống kê toán học xử lí số liệu:

Sử dụng chương trình Microsoft Office – Excell: Nạp các số liệu, dùng hàm AVERAGE để tính giá trị trung bình và hàm VAR để tính sai số, vẽ biểu đồ, lập các bảng biểu .



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Quy trình chiết, tách các phân đoạn từ vỏ quả măng cụt

Để tìm hiểu thành phần hóa học của vỏ quả măng cụt, chúng tôi tiến hành chiết các hợp chất trong vỏ quả măng cụt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ethanol, điclometan, n-hexan và etylacetat. Quy trình được trình bày trên hình 3





Hình 3. Quy trình tách, chiết phân đoạn vỏ quả măng cụt tươi

Từ sơ đồ quy trình tách chiết trên, chúng ta thấy được hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả măng cụt như sau:



Bảng 4. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả măng cụt

Phân đoạn

Khối lượng (g)

Hiệu suất chiết rút

(% nguyên liệu khô)

Vỏ măng cụt tươi

2000




Cao ethanol

387

19,35%

Cao điclometan

8

0,40%

Cao n-hexan

25

1,25%

Cao etylacetat

48

2,40%

Cao nước

105

5,25%

Kết quả này cho thấy trong vỏ quả măng cụt có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Phương pháp tách chiết này giúp tách chiết các chất có độ phân cực từ thấp đến cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất sau này. Tiếp theo chúng tôi tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng trên hệ dung môi: Toluen:Etylacetat:Aceton:Axit formic = 5 : 3 : 1 : 1. Bản mỏng được được phun bằng hơi H2SO4 và soi trên máy soi UV ở bước sóng 365 nm. Kết quả thu được thể hiện ở sắc kí đồ hình 4.





Hình 4. Sắc kí đồ của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt

1-Phân đoạn ethanol; 2-Phân đoạn ethylacetat;

3-Phân đoạn n-hexan; 4-Phân đoạn điclometan

3.2. Định tính sơ bộ thành phần phần hóa học của dịch chiết

Bằng cách sử dụng các phản ứng đặc trưng để khảo sát thành phần hóa học của dịch chiết từ vỏ quả măng cụt. Chúng tôi thu được kết quả như ở bảng 5:



Bảng 5. Kết quả thử định tính của các lớp chất của dịch chiết từ vỏ quả măng cụt

Nhóm chất

Phản ứng đặc trưng

Phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt

Ethanol

Điclometan

n-hexan

Etylacetat

Polyphenol

Flavonoid

Shinoda

++

+++

++

-

Diazo

-

-

-

-

H2SO4

++

++

-

+++

NaOH10%

+++

+++

+++

+++

Catechin

Vanilin1% NaCl

+++

+++

+++

+++

Tannin

Vanilin- H2SO4

+++

+++

+++

+++

Gelatin/NaCl

+++

++

+++

-

FeCl3

+++

+++

+++

+++

(CH3COO)2Pb

+++

+++

+++

+++

Alkaloid

Bouchardat

+

+

+

-

Vans-Mayer

-

-

-

-

Dragendorff

+

-

+

+

Glucoside

Keller-Killian

+

++

+

-

Sapomin

Phản ứng tạo bọt

+++

+++

+++

+++

Từ kết quả của bảng trên, chúng tôi có thể đưa ra kết luận sơ bộ về thành phần hóa học chủ yếu của vỏ quả măng cụt thuộc nhóm chất polyphenol như tannin, catechin, flavonoid và saponin, hàm lượng alkaloid và glucoside rất ít. Trong đó phân đoạn ethanol cho phản ứng dương tính với polyphenol mạnh nhất.



3.3. Định lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết

Định lượng polyphenol tổng số trong cao chiết điclometan, n-hexan và etylacetat của vỏ quả măng cụt theo phương pháp Folin-Ciocalteau. Kết quả được trình bày ở bảng 6.



Bảng 6. Hàm lượng polyphenol tổng số của các phân đoạn dịch chiết

Phân đoạn

n- hecxan

Ethyl acetat

Ethanol

Hàm lượng (mg) polyphenol tổng số/100g nguyên liệu

4028

4252

5130

Tỷ lệ (%)

4,028

4,252

5,130

Như vậy trong 100 g vỏ quả măng cụt tươi ngâm chiết có hàm lượng polyphenol tổng số trong phân đoạn n- hecxan là 4,028 g (4,028%), phân đoạn Ethyl acetat là 4,252 g (4,252%) và phân đoạn Ethanol là 5,130 g (5,130%). Kết quả này cho thấy các phân đoạn dịch chiết từ ethanol, n-hexan và etylacetat của vỏ quả măng cụt đều chứa một lượng lớn polyphenol và hoàn toàn phù hợp với kết quả định tính và sắc kí đồ đã nêu ở trên. Với kết quả này chúng tôi quyết định dùng cao chiết phân đoạn ethanol, n-hexan và etylacetat của vỏ quả măng cụt để nghiên cứu tác dụng hạ glucose và lipid máu trên mô hình chuột mô hình chuột béo phì và ĐTĐ typ 2.

3.4. Kết quả thử độc tính cấp (LD50) theo đường uống

Xác định LD50 của dịch chiết điclometan, n-hexan và etylacetat của vỏ quả măng cụt trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke. Chuột để nhịn đói trước 16h thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8000mg/kg thể trọng (liều tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết ethanol, n-hexan và etylacetat của vỏ quả măng cụt. Kết quả được trình bày ở bảng 7:



Bảng 7. Kết quả thử độc tính cấp (LD50) theo đường uống

Phân đoạn

Liều uống (mg/kg)

Tổng số chuột

Số chuột chết

% chuột chết

Ethanol

5000

6000


7000

8000


10

10

10



10

0

0

0



0

0%

0%

0%



0%

n-hexan

5000

6000


7000

8000


10

10

10



10

0

0

0



0

0%

0%

0%



0%

etylacetat

5000

6000


7000

8000


10

10

10



10

0

0

0



0

0%

0%

0%



0%

Qua 72 giờ theo dõi thì với các liều 5000, 6000, 7000 và 8000 mg/kg thể trọng không có chuột bị chết. Liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng (liều tối đa cho phép) cũng không có chuột bị chết. Vì vậy chúng tôi chưa tính được LD50 theo đường uống. Điều này cũng cho thấy dịch chiết ethanol, n-hexan và etylacetat của vỏ quả măng cụt được sử dụng theo đường uống không gây độc cho chuột. Vì vậy việc điều trị cho chuột uống các cao phân đoạn dịch chiết này trong quá trình thí nghiệm là rất an toàn.

3.5. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm

3.5.1. Thể trọng chuột trung bình của các lô chuột thí nghiệm

Chuột được lựa chọn là chuột nhắt trắng chủng Swiss 4 tuần tuổi do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp có khối lượng từ 14 - 15 g/con, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 6 con. Lô 1 được nuôi với chế độ ăn bình thường do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp còn các lô còn lại (từ lô 2 đến lô 11) được nuôi bằng chế độ thức ăn giàu chất béo và Cholesterol. Sau 28 ngày nuôi chúng tôi tiến hành xác định thể trọng trung bình của các lô chuột thí ngiệm và thu được kết quả như sau:



Bảng 8. Thể trọng trung bình của các lô chuột ban đầu và sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm

Lô chuột

m0 (g)

m28 (g)

Khối lượng tăng (%)

% tăng so với đối chứng

Lô nuôi thường

(lô 1)


14,8 ± 1,3

31,5 ± 1,2

 112,84 %

 42,86 %

Lô nuôi ăn béo

(lô 2 – lô 11)



15,1 ± 1,2

45,0 ± 1,3

198,01 %


mo: Thể trọng chuột trước khi tiến hành thí nghiệm

m28: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi với hai chế độ ăn khác nhau



Hình 5. Thể trọng chuột trung bình trước và sau 28 ngày nuôi theo hai chế độ ăn khác nhau




Hình 6. Chuột nuôi thường và chuột béo phì sau 28 ngày nuôi

Kết quả thu được cho thấy ở các lô chuột ăn thức ăn bình thường sau 28 ngày nuôi thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày đầu thí nghiệm là 21,7 g (tăng 67,6 %), các lô chuột nuôi với chế độ ăn lượng chất béo cao thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày đầu thí nghiệm là 26,0 g (tăng 136,8 %). Như vậy, chuột nuôi với chế độ ăn béo có khối lượng có thể lớn hơn chuột nuôi thường là 13,5 g tương đương tăng 42,9 % (mức ý nghĩa 0,001). Như vậy có thể kết luận chuột được nuôi với bằng thức ăn giàu lipid đã béo phì về khối lượng. Kết quả này phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu thực nghiệm trên chuột của các tác giả trong nước và ngoài nước. Những nghiên cứu về chuyển hóa các chất ở tế bào và mô cho chúng ta thấy rằng khi tiêu thụ chất béo vượt quá nhu cầu năng lượng của cơ thể thì chất béo sẽ tích tụ ở mô mỡ và gây ra béo phì. Như vậy, chế độ ăn giàu chất béo là một trong những yếu tố nguy cơ gây bệnh béo phì và những bệnh mãn tính có liên quan.



3.5.2. Các chỉ số hóa sinh của các lô chuột thí nghiệm sau 28 ngày nuôi

Để có thêm cơ sở cho những kết luận này chúng tôi tiến hành xét nghiệm một số chỉ lipid, glucose và men gan để xác định là chuột có thực sự béo phì hay không. Kết quả xác định chỉ tiêu lipid máu như Cholesterol tổng số, triglycerid, HDL và LDL, glucose máu của chuột được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.3.



Bảng 9. Một số chỉ số hóa sinh của các lô chuột sau 28 ngày nuôi

Chỉ số

(mmol/l)

Lô nuôi thường

(lô 1)

Lô nuôi béo

(lô 2 – lô 11)

Tỉ lệ thay đổi của lô béo (%)

Cholesterol tổng (TC)

4,21  0,035

6,82  0,054

65,53%

Triglycerid (TG)

1,24  0,021

2,50 0,015

101,61 %

HDLC

1,80  0,019

1,01  0,014

43,89 %

LDLC

0,68  0,021

1,50 0,018

210,59 %

Glucose

5,32  0,21

7,51  0,24

41,17 %

(p < 0,05)



Hình 7. Các chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm nuôi ăn lượng chất béo cao và ăn thức ăn thường

Kết quả trên cho thấy ở các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng lipid cao đều có chỉ số lipid máu cao hơn hẳn lô chuột ăn thức ăn bình thường. Cụ thể là nồng độ cholestron máu tăng 65,53 %, triglycerid máu tăng 101,61 %, HDLC giảm 43,89 %, LDLC tăng 210,59 % và glucose máu tăng 41,17 %. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với thực tế, bởi vì chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao sau một thời gian rất dễ bị rối loạn trao đổi lipid và kéo theo sự rối loạn trao đổi glucid mà biểu hiện cụ thể là sự tăng nồng độ glucose máu bất thường. Kết quả này đã góp phần bổ sung thêm một cơ sở thực nghiệm nữa là bệnh thừa cân và béo phì là một trong những nguyên nhân rủi ro cao gây ra bệnh đái tháo đường, mỡ máu, các bệnh tim mạch,... Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây.



3.6. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt lên chuột béo phì thực nghiệm

3.6.1. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt lên khối lượng cơ thể chuột

Để tiến hành nghiên cứu khả năng giảm trọng lượng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm bằng cách cho chuột uống cao các phân đoạn dịch chiết với liều 2000mg/kg thể trọng vào buổi sáng hàng ngày. Quá trình điều trị đựơc thực hiện trong vòng 21 ngày và trong thời gian này chuột được cung cấp thức ăn và nước uống bình thường.



Bảng 10. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt

Lô chuột điều trị

m28

m28+21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

31,5  1,2

35,3  2,1

 12,06 %

Lô 2 (Béo phì không điều trị)

44,1  1,1

53,2  2,5

 20,63 %

Lô 3 (Metf)

44,9 ± 1,3

42,5 ± 1,5

 5,30 %

Lô 4 (EtOH)

46,1  2,3

41,2  1,4

10,80 %

Lô 5 (EtoAc)

45,8  1,7

43,1  1,3

 5,89 %

Lô 6 (n-hex)

44,7  2,1

42,3  1,6

 5,37 %


m28: Thể trọng chuột trước khi điều trị

m28+21: Thể trọng chuột sau 21 ngày điều trị



Hình 8. Thể trọng các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Sau 21 ngày điều trị, khi đối chứng (lô 1) và lô béo phì không điều trị chỉ cho uống nước không cho uống dịch chiết thì khối lượng vẫn tiếp tục tăng đặc biệt là lô béo phì tăng 20,63%. Trong khi đó các lô chuột được điều trị bằng các cao cô của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt và metformin khối lượng cơ thể giảm dần. Mức độ giảm thể trọng mạnh nhất là ở lô chuột cho uống dịch chiết cao ethanol (lô 3) giảm 10,8%; tiếp đến là các lô cho uống dịch chiết cao etylacetat (5,89%). n-hexan (5,37%) và cuối cùng lô điều trị bằng metformin (5,30%). Mức độ giảm thể trọng ở các lô chuột cho uống bằng các cao phân đoạn là không tuyến tính, giảm mạnh hơn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 21. Từ kết quả trên chúng tôi có thể rút ra kết luận là vỏ quả măng cụt có các hợp chất tự nhiên có khả năng làm giảm thể trọng của chuột béo phì thực nghiệm khá rõ ràng sau 21 ngày điều trị và giảm mạnh hơn so với khi điều trị bằng thuốc Metformin..



3.6.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt lên một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột béo phì thực nghiệm

Để có thêm cơ sở cho việc đánh giá tác dụng của của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt lên chuột béo phì thực nghiệm chúng tôi tiến hành xét nghiệm một số chỉ số hóa sinh trong huyết thanh chuột: glucose, cholesterol, triglycerid, HDLC, LDLC, GOT và GPT.



3.6.2.1. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt lên một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột béo phì

3.6.2.1.1. Nồng độ glucose (mmol/l) máu chuột béo phì

Kết quả phân tích chỉ số glucose huyết được thể hiện ở bảng 11 và hình 9.



Bảng 11. Chỉ số glucose huyết (mmol/l) trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

G0

G21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

5,32 ± 0,2

5,57 ± 0,18

 4,70 %

Lô 2 (Béo phì không điều trị)

7,51± 0,02

7,6 ± 0,014

 1,20 %

Lô 3 (Metf)

7,5 ± 0,022

5,9 ± 0,072

21,34%

Lô 4 (EtOH)

7,48 ± 0,056

5,42 ± 0,039

27,83 %

Lô 5 (EtoAc)

7,43 ± 0,054

6,25 ± 0,187

16,78 %

Lô 6 (n-hex)

7,5 ± 0,079

6,81 ± 0,095

 9,32 %

Go: chỉ số glucose huyết trước khi điều trị

G21: Chỉ số glucose huyết sau 21 ngày điều trị



Hình 9. Chỉ số glucose huyết của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Từ số liệu bảng 11 và biểu đồ ở hình 9 thu được chúng tôi thấy lô chuột đối chứng âm (lô 1) có nồng độ glucose máu tăng nhẹ và nhìn chung là khá ổn định ở mức bình thường, lô chuột đối chứng dương (lô 2) khá ổn định và ở mức nồng độ glucose huyết vẫn còn cao. Trong khi đó tất cả các lô chuột được điều trị bằng metformin và cao các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt thì nồng độ glucose máu đều giảm. Lô điều trị bằng metformin biểu hiện nồng độ glucose giảm 21,34%. Trong khi đó các lô chuột được điều trị bằng các cao phân đoạn dịch chiết, đặc biệt điều trị bằng cao phân đoạn ethanol có mức giảm lớn nhất (27,83 %) lớn hơn cả lô điều trị bằng metformin với p < 0,05, tiếp đến là lô được điều trị bằng cao etylacetat (16,78%) và n-hexan (9,32%). Như vậy ở lô chuột được điều trị bằng ethanol nồng độ glucose huyết biểu hiện còn giảm nhiều hơn so với lô chuột được điều trị bằng Metformin. Qua kết quả thu được ở trên chúng tôi thấy rằng trong các dịch chiết vỏ quả măng cụt có chứa các hợp chất tự nhiên có tác dụng hạ đường huyết trong máu chuột béo phì khá hiệu quả.



3.6.2.1.2 Nồng độ cholesterol (mmol/l) máu chuột béo phì

Kết quả phân tích chỉ số cholesterol trong máu chuột trước và sau 21 ngày điều trị được thể hiện ở bảng 12 và hình 10.



Bảng 12. Chỉ số cholesterol (mmol/l) huyết của chuột béo phì trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

C0

C21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

4,12 ± 0,038

4,21 ± 0,056

 2,18 %

Lô 2 (Béo phì không điều trị)

6,82 ± 0,038

6,93 ± 0,018

 1,61 %

Lô 3 (Metf)

6,79 ± 0,023

5,35 ± 0,014

 21,21%

Lô 4 (EtOH)

6,73 ± 0,012

5,53 ± 0,034

 17,83 %

Lô 5 (EtoAc)

6,81 ± 0,029

5,23 ± 0,023

23,20 %

Lô 6 (n-hex)

6,69 ± 0,123

5,93 ± 0,026

 11,36 %

Co: chỉ số cholesterol trước khi điều trị

C21: Chỉ số cholesterol sau 21 ngày điều trị



Hình 10. Chỉ số cholesterol huyết của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Kết quả phân tích hàm lượng cholesterol được trình bày trong bảng 12 và biểu đồ hình 10 cho thấy hàm lượng cholesterol trong máu của lô chuột đối chứng âm (lô 1) và lô chuột đối chứng dương (lô 2) vẫn tăng khá ổn định (tăng 2,18 % và 1,61 %). Các lô điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt và metformin cho thấy hàm lượng cholesterol giảm tương ứng từ 11,36 % đến 23,20 %. Trong đó ở lô chuột điều trị bằng cao etylacetat (lô 5) là lô giảm lớn nhất (23,20 %), tiếp đến là lô điều trị bằng metformin (lô 3) giảm 21,21%, tiếp đến là lô điều trị bằng cao ethanol (lô 4) giảm 17,83% và cuối cùng là lô điều trị bằng n-hexan (lô 6) giảm 11,36%. Theo các nghiên cứu của nhiều tác giả thì hàm lượng cholesterol trong máu bệnh nhân béo phì thường cao hơn so với mức bình thường. Điều này dễ gây ra nguy cơ “tăng mỡ máu” một biểu hiện bệnh lý nghiêm trọng. Hơn nữa khi hàm lượng cholesterol tăng sẽ làm cho hàm lượng LDL cũng tăng theo. Hơn nữa, theo các kết quả nghiên cứu trên người cho thấy, nếu hàm lượng LDL tăng 0,6 % thì nguy cơ nhồi máu cơ tim tăng lên 1% [3, 8]. Do đó xét về mặt sinh học cơ thể thì sự giảm hàm lượng cholesterol của các lô chuột được điều trị bằng cao chiết vỏ quả măng cụt là rất có ý nghĩa, với p < 0,05.



3.6.2.1.3. Nồng độ triglycerid (mmol/l) máu chuột béo phì

Trong điều trị béo phì, một trong những chỉ số hoá sinh được đặc biệt quan tâm đến là hàm lượng triglycerid trong máu. Khi hàm lượng triglycerid giảm đáng kể sẽ được xem là hướng điều trị có hiệu quả. Nghiên cứu thực nghiệm điều trị béo phì trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm bằng dịch chiết vỏ quả măng cụt đã thu được một số kết quả nhất định. Kết quả này được thể hiện trên bảng 13 và hình 11.


Bảng 13. Chỉ số triglycerid (mmol/l) trước và sau 21 ngày điều trị


Lô chuột điều trị

T0

T21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

1,24 ± 0,011

1,20 ± 0,054

 3,23 %

Lô 2 (Béo phì không điều trị)

2,50 ± 0,031

2,43 ± 0,019

 2,80 %

Lô 3 (Metf)

2,23 ± 0,015

1,67 ± 0,018

 25,11 %

Lô 4 (EtOH)

2,53 ± 0,023

1,72 ± 0,034

32,02 %

Lô 5 (EtoAc)

2,470 ± 0,034

1,93 ± 0,026

 21,86 %

Lô 6 (n-hex)

2,50 ± 0,072

2,22 ± 0,022

 11,20 %



To: chỉ số triglycerid trước khi điều trị

T21: Chỉ số triglycerid sau 21 ngày điều trị



Hình 11. Chỉ số triglycerid của các lô chuột béo phì trước và sau 21 ngày điều trị

Kết quả trên cho thấy sau 21 ngày điều trị bằng metformin và cao các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt thì chỉ số triglycerid của chuột ở tất cả các lô đều giảm rất mạnh, trong khi đó ở lô chuột bình thường (lô 1) và lô chuột béo phì không điều trị (lô 2) thì hàm lượng triglycerid tương đối ổn định. Trong các lô chuột được điều trị bằng cao các phân đoạn thì lô chuột được điều trị bằng cao phân đoạn ethanol có mức giảm lớn nhất (giảm 31,20 %). Các lô chuột được điều trị bằng các metformin, phân đoạn etylacetat và n-hexan có mức giảm lần lượt là 25,11 %; 22,80 % và 11,20 %. Qua đây có thể rút ra kết luận là các hợp chất tự nhiên trong vỏ quả măng cụt có khả năng giảm rất tốt chỉ số triglycerid máu của chuột béo phì. Đặc biệt là ở lô chuột điều trị bằng cao ethanol thì sự giảm nồng độ triglycerid còn cao hơn ở lô chuột điều trị bằng metformin. Chúng ta đã biết ở những bệnh nhân béo phì thì hàm lượng triglycerid trong máu thường cao hơn so với người bình thường. Và khi hàm lượng triglycerid tăng cao sẽ kéo theo tăng nguy cơ xơ vữa động mạch, ức chế sự hoạt động của insulin (một hormone làm giảm đường huyết). Điều này phần nào giải thích tại sao nồng độ glucose huyết của chuột béo phì cao hơn so với chuột bình thường. Vì vậy việc giảm nồng độ triglycerid sau khi điều trị bằng các cao phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt là rất có ý nghĩa về mặt dược lý.



3.6.2.1.4. Nồng độ HDLC (mmol/l) máu chuột béo phì

HDLC là một loại lipoprotein có vai trò quan trọng trong việc lấy cholesterol ra khỏi máu và ngăn cho chúng không xâm nhập vào thành động mạch, làm giảm khả năng mắc các chứng bệnh về tim mạch, các bệnh lien quan đến triệu chứng “ tăng mỡ máu ”. Theo các nhà khoa học thì chỉ cần tăng hàm lượng HDLC lên 1% là có thể giảm tới 3 - 4% nguy cơ tử vong do nhồi máu cơ tim. Chính vì vậy, việc tìm cách nâng hàm lượng HDLC trong máu có ý nghĩa rất quan trọng đối với cơ thể con người.Trong điều trị các chứng bệnh liên quan đến mỡ máu, xơ vữa động mạch,…[3, 8] bằng các tân dược cũng nhằm mục đích này, tuy nhiên sử dụng thuốc tân dược thường có phản ứng phụ gây hại cho sức khỏe. Các hướng nghiên cứu tìm phương thuốc hữu hiệu từ nguồn thảo dược thiên nhiên nhằm nâng cao hàm lượng HDLC đang được nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu. Việc điều trị chuột béo phì thực nghiêm bằng dịch chiết vỏ quả măng cụt bước đầu có kết quả. Cụ thể, chỉ số HDLC trong máu của 5 lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị được thể hiện rõ trong bảng 14 và hình 12.



Bảng 14. Chỉ số HDLC (mmol/l) trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

H0

H21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

1,80 ± 0,034

1,84 ± 0,075

 2,20 %

Lô 2 (Béo phì không điều trị)

1,01 ± 0,022

0,75 ± 0,037

 2,97 %

Lô 3 (Metf)

1,23 ± 0,032

1,32 ± 0,045

 7,30%

Lô 4 (EtOH)

1,11 ± 0,035

1,25 ± 0,05

11,20 %

Lô 5 (EtoAc)

1,24 ± 0,038

1,35 ± 0,045

 8,87 %

Lô 6 (n-hex)

1,19 ± 0,046

1,23 ± 0,068

 3,36 %



Ho: chỉ số HDLC trước khi điều trị

H21: Chỉ số HDLC sau 21 ngày điều trị



Hình 12. Chỉ số HDLC của các lô chuột béo phì trước và sau 21 ngày điều trị

Kết quả cho thấy ở lô đối chứng âm (lô 1) chỉ số HDLC hầu như không thay đổi, lô đối chứng dương (lô 2) chỉ số HDLC giảm nhẹ (2,97 %). Còn các lô được điều trị bằng metformin và các phân đơạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt thì chỉ số HDLC đều tăng so với lô đối chứng, cụ thể như sau: Lô chuột được điều trị bằng dịch chiết ethanol vỏ quả măng cụt (lô 4) chỉ số HDLC tăng 11,20 % và lô điều trị bằng ethyl acetat (lô 5) chỉ số HDLC tăng 8,87 % vượt so với lô điều trị bằng Metformin (lô 3) chỉ số HDLC tăng 7,30 % với p < 0,05. Từ kết quả trên cũng cho thấy việc điều trị bằng phân đoạn ethanol có hiệu quả nhất và có ý nghĩa thực tiễn quan trọng.



3.6.2.1.5. Nồng độ LDLC (mmol/l) máu chuột béo phì

Chỉ số LDLC trong máu chuột của 6 lô trước và sau điều trị được thể hiện rõ trong bảng và hình.Kết quả cho thấy chỉ số LDLC trong máu chuột ở lô đối chứng âm (lô 1) hầu như không thay đổi, ở lô đối chứng dương (lô 2) chỉ số LDLC tăng nh ẹ 3,30%, còn các lô điều trị bằng Metformin và dịch chiết các phân đoạn vỏ quả măng cụt từ ethanol, ethylacetat, n- hecxan đều giảm lần lượt là 30%; 37,57% ; 20,97% ; 6,84%.Như vậy tác dụng giảm nồng độ LDLC cao nhất vẫn là phân đoạn ethanol vỏ quả măng cụt với p < 0,05.



Bảng 15. Chỉ số LDLC (mmol/l) máu chuột béo phì trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

L0

L21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

0,68 ± 0,031

0,65 ± 0,016

 4,40 %

Lô 2 (Béo phì không điều trị)

1,50 ± 0,046

1,55 ± 0,035

 3,30 %

Lô 3 (Metf)

1,50 ± 0,02

1,05 ± 0,02

 30,00 %

Lô 4 (EtOH)

1,65 ± 0,02

1,03 ± 0,014

37,57 %

Lô 5 (EtoAc)

1,43 ± 0,054

1,13 ± 0,01

 20,97 %

Lô 6 (n-hex)

1,46 ± 0,027

1,36 ± 0,015

 6,84 %



Lo: chỉ số LDLC trước khi điều trị

L21: Chỉ số LDLC sau 21 ngày điều trị


Hình 13. Chỉ số HDLC của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Từ các kết quả thu được ở trên, nói một cách khái quát, tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt lên thể trọng chuột và các chỉ số mỡ máu là giảm có nghĩa thống kê, với p < 0,05. Trong đó hiệu quả nhất là phân đoạn dịch chiết ethanol vỏ quả măng cụt đã làm giảm 37,57% chỉ số LDLC.

So sánh với các kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước, từ kết quả nghiên cứu về khả năng điều trị giảm cân và mỡ máu của dịch chiết vỏ quả măng cụt trên mô hình chuột béo phì thực nghiêm, chúng tôi thu được kết quả khả quan.

3.6.2.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt lên một số chỉ số hóa sinh máu ở chuột ĐTĐ typ 2

3.6.2.2.1. Chỉ số glucose máu ở chuột ĐTĐ typ 2

Với các mô hình thí nghiệm như trong phần phương pháp nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả được thể hiện trong bảng 15 và hình 14 dưới đây.



Bảng 16. Chỉ số glucose (mmol/l) trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

G0

G21

% thay đổi

Lô 7 (ĐTĐ không điều trị)

18,72

21,12

 12,82 %

Lô 8 (Metf)

18,50

12,10

 34,59 %

Lô 9 (EtOH)

18,83

12,82

31,92 %

Lô 10 (EtoAc)

18,45

15,01

18,64 %

Lô 11 (n-hex)

18,65

16,54

 11,31 %




Hình 14. Chỉ số glucose huyết của các lô chuột ĐTĐ typ 2 trước và sau 21 ngày điều trị

Nhìn vào bảng 16 và hình 14 cho thấy: ở lô chuột thường không điều trị (KĐT) nồng độ glucose sau 21 ngày không thay đổi. Trong khi đó ở lô chuột đái tháo đường KĐT nồng độ glucose không những không giảm mà còn có xu hướng tăng. Điều đó cho thấy rằng glucose máu tăng cao là biểu hiện bệnh ĐTĐ thực sự và ngày càng nghiêm trọng hơn.


Về tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến vỏ quả măng cụt đến khả năng hạ đường huyết ở chuột ĐTĐ cho thấy rằng: với cùng liều điều trị 2000mg/kg phân đoạn ethanol có tác dụng mạnh nhất và rõ nhất (giảm 31,92%), trong khi phân đoạn EtoAc giảm 18,64%, phân đoạn n-hexan chỉ giảm 11,31%. Các số liệu này vẫn có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Thuốc metformin tỏ ra là loại thuốc hiệu quả trong hạ glucose huyết của bệnh ĐTĐ với mức giảm 34,59% với liều 500mg/kg thể trọng. Tuy nhiên chúng tôi cho rằng, đây vẫn là một kết quả khá khả quan vì metformin là loại thuốc nguyên chất và đã qua tinh chế.

Kết quả trên có thể được giải thích là do trong vỏ quả măng cụt có chứa nhiều hợp chất có tác dụng tổng hợp làm giảm glucose huyết theo một cơ chế nào đó. Các hợp chất đó có thể là các flavonoid, glucoside và saponin vì có nhiều ở vỏ quả măng cụt (bảng 5 và 6). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, không chỉ có flavonoid là nhóm hợp chất duy nhất có tác dụng chữa bệnh ĐTĐ mà các polyphenol khác (đã nêu ở phần tổng quan) cũng có tác dụng này. Nếu thừa nhận rằng PĐ EtOAc của chúng tôi có nhiều flavonoid nhất (theo lý thuyết và theo các khảo sát định tính, định lượng nói ở trên) thì kết quả này là một ví dụ nữa chứng minh hoạt tính chữa bệnh của các nhóm hợp chất khác nữa ngoài flavonoid. Bởi vậy muốn phát triển thực phẩm chức năng chữa ĐTĐ từ vỏ quả măng cụt thì cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về các lớp chất trong mỗi phân đoạn. Đặc biệt là trong phân đoạn ethanol đã thể hiện hiệu quả tốt nhất.



3.6.2.2.2. Chỉ số GOT máu chuột ĐTĐ typ 2

Khi chúng tôi tiến hành tiêm màng bụng chuột béo phì bằng STZ, ngoài việc gây tăng nồng độ glucose trong máu chuột chúng tôi tiếp tục xét nghiệm hai chỉ số quan trọng để đánh giá chức năng gam là enzym GOT và GPT. Chúng tôi nhận thấy rằng ở các lô chuột béo phì có tiêm STZ thì các chỉ số hoạt độ GOT và GPT tăng lên rất cao so với với lô đối chứng. Điều này chứng tỏ STZ đã gây độc và phá hủy tế bào gan hay nói cách khác là làm rối loạn thẩm thấu màng tế bào gan. Khi đó sẽ dẫn tới sự giải phóng vào huyết thanh các enzym đặc hiệu là GOT và GPT, được coi là những chỉ tiêu sinh học đáng tin cậy của sự hủy hoại tế bào gan. Sự hủy tế bào gan gây tăng cao hoạt độ và sớm GOT, GPT là do hàm lượng GPT và GOT tăng cao trong máu ở chuột bệnh ĐTĐ. Chính vì vậy ngoài việc nghiên cứu tác dụng hạ glucose và lipid của các dịch chiết vỏ quả măng cụt chúng tôi quyết định khảo sát tác dụng của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt tới enzym GOT và GPT của gan.

Bảng 17. Chỉ số GOT trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

GOT0

GOT21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

151,50

154,21

 1,79 %

Lô 7 (ĐTĐ không điều trị)

249,13

250,32

 0,48 %

Lô 8 (Metf)

235,13

243,54

 3,58 %

Lô 9 (EtOH)

258,13

185,23

28,24 %

Lô 10 (EtoAc)

240,13

215,52

 10,25 %

Lô 11 (n-hex)

260,13

225,45

 13,33 %



GOTo: chỉ số GOT trước khi điều trị

GOT21: Chỉ số GOT sau 21 ngày điều trị



Hình 15. Chỉ số GOT của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Dựa vào kết quả của bảng và hình chúng tôi nhận thấy rằng ở lô 1 (lô bình thường) và lô 7 (ĐTĐ typ 2 không điều trị) thì chỉ số GOT tương đối ổn định và STZ và ĐTĐ vẫn gây tác hại tới chức năng gan. Trong khi đó ở các lô điều trị bằng metformin và các cao phân đoạn dich chiết vỏ quả măng cụt thì chỉ số GOT đều giảm nhưng ở mức độ khác nhau. Giảm tốt nhất là ở lô điều trị bằng cao ethanol (lô 9) giảm 28,24 %, tiếp đến là lô điều trị bằng cao n-hexan (lô 11) giảm 13,33 %, tiếp đến là lô điều trị bằng cao ethylacetat (lô 10) giảm 10,25% và cuối cùng là lô điều trị bằng metformin (lô 8) giảm 3,58%. Như vậy các lô điều trị bằng các cao phân đoạn vỏ quả măng cụt đã giúp cho hoạt độ của enzyme GOT dần phục hồi lại. Từ kết quả trên cũng cho thấy việc điều trị bằng phân đoạn ethanol có hiệu quả nhất và có ý nghĩa thực tiễn quan trọng.



3.6.2.2.3. Chỉ số GPT máu chuột ĐTĐ typ 2

Cũng giống như GOT, GPT là môt trong những chỉ số sinh học rất quan trọng trong việc đánh giá chức năng của gan. Sự phục hồi hoạt độ GPT dù ít hay nhiều cũng đều có ý nghĩa sinh học quan trọng.



Bảng 18. Chỉ số GPT trước và sau 21 ngày điều trị

Lô chuột điều trị

GPT0

GPT21

% thay đổi

Lô 1 (Bình thường)

47,50

45,97

 3,22 %

Lô 7 (ĐTĐ không điều trị)

75,01

74,65

 0,48 %

Lô 8 (Metf)

76,54

71,33

 6,81 %

Lô 9 (EtOH)

74,62

52,34

29,86%

Lô 10 (EtoAc)

74,12

58,34

 21,29 %

Lô 11 (n-hex)

76,15

65,72

 10,43 %



GPTo: chỉ số GPT trước khi điều trị

GPT21: Chỉ số GPT sau 21 ngày điều trị



Hình 16. Chỉ số GPT của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị

Kết quả ở bảng và hình trên cho thấy, ở lô 1 (đối chứng âm) chỉ số GPT duy trì ở mức khá ổn định ở mức bình thường, lô 7 (không điều trị) thì chỉ số GPT vẫn duy trì ở mức cao. Ở lô điều trị bằng metformin thì sự giảm nồng độ GPT ở mức thấp (giảm 6,81%). Trong khi đó, ở lô điều trị bằng cao phân đoạn vỏ quả măng cụt có biểu hiện sự giảm hoạt độ GPT là tốt hơn và tốt nhất ở lô điều trị bằng cao ethanol tổng số (giảm 29,86%), tiếp đến là lô điều trị bằng cao ethylacetat (giảm 21,29%) và cuối cùng là lô điều trị bằng cao n-hexan (giảm 10,43%).


Như vây, ở những lô chuột gây ĐTĐ typ 2 khi được điều trị bằng các cao phân đoạn vỏ quả măng cụt đặc biệt là cao EtOH thì chỉ số GOT và GPT đều giảm và gần tương đương với lô đối chứng. Điều này đã chứng tỏ rằng ngoài tác dụng hạ glucose và lipid máu thì các cao phân đoạn vỏ quả măng cụt đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm phục hồi dần hoạt độ của emzym GOT và GPT.
3.7. Khảo sát hoạt tính của vỏ quả măng cụt trong việc ức chế enzym glucosidase

    • Cao ethanol: Độ hấp thu Atb khi không có chất ức chế là 0,255.

Bảng 19: Độ hấp thu Atb và % ức chế của cao ethanol theo nồng độ.

Nồng độ

µg/ml


% Ức chế

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

5

79,19

77,62

71,05

76,05±4,16

25

102,4

102,4

99,21

101,3±1,81

50

110,2

109,8

111,0

110,3±0,60

75

11,8

112,2

112,6

112,2±0,39




Hình 13. Đường biểu diễn % ức chế của cao ethanol theo nồng độ

Nhận xét: Dựa vào kết quả % ức chế ở các nồng độ, kết luận cao ethanol có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase ở nồng độ dưới 5 μg/ml.



    • Cao Ethylacetat: Độ hấp thu Atb khi không có chất ức chế là 0,168.

Bảng 20: Độ hấp thu Atb và % ức chế của cao ethylacetat theo nồng độ.


Nồng độ

µg/ml


% Ức chế

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

5

3,168

13,86

5,544

7,524±5,615

25

11,48

11,48

13,27

12,08±1,03

50

13,28

13,28

16,83

14,46±2,06

75

21,58

20,40

31,09

24,36±5,86

100

38,22

38,81

37,62

38,22±0,59




Hình 14. Đường biểu diễn % ức chế của cao ethylacetat theo nồng độ

Nhận xét: Dựa vào phương trình suy ra giá trị IC50 của cao ethylacetat là: IC50 = 145,8μg/ml.


    • Cao n-hexan: Độ hấp thu Atb khi không có chất ức chế là 0.132.

Bảng 21: Độ hấp thu Atb và % ức chế của cao n-hexan theo nồng độ.

Nồng độ

µg/ml


% Ức chế

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

5

2,727

3,030

4,545

3,282±1,157

25

9,091

6,818

7,576

7,828±1,157

50

9,848

10,61

9,848

10,10±0,44

75

24,24

23,48

25,00

24,24±0,76

100

28,79

29,54

30,30

29,54±0.76




Hình 15. Đường biểu diễn % ức chế của cao n-hexan theo nồng độ.

Nhận xét: Dựa vào phương trình suy ra giá trị IC50 của cao n-hexan là: IC50 = 171,8μg/ml.
* Nhận xét chung:

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 0.5 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   2   3   4




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương