* Tách chiết ADN thực vật

+ Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học: Nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng bằng
cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần bên trong tế bào. Trong một số
trường hợp, người ta có thể dùng thêm enzyme cellulase để phân hủy thành cellulose.
+ Sử dụng đệm có chất tẩy rửa (CATB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN
+ Sử dụng hóa chất ức chế nuclease (EDTA) nhằm bảo vệ sự nguyên vẹn của ADN trước
sự tác động của nuclease nội bào.
+ Tách bỏ các tạp chất, protein ra khỏi hỗn hợp nhờ li tâm phân đoạn nhờ hỗn hợp các hóa
chất chloroform, isoamyl alkohol, phenol…
+ Thu hồi ADN bằng cách tạo kết tủa với ethanol hoặc isopropanol. Sau đó li tâm loại bỏ
dịch lỏng và thu hồi cặn ADN trong hỗn hợp.
+ Hòa tan ADN bằng nước ( sử dụng ngay sau đó) hoặc dung dịch đệm (bảo quản lâu dài).
* Tách chiết ADN vi khuẩn
Về nguyên tắc chung, việc tách chiết ADN từ vi khuẩn cũng giống tách chiết ADN từ thực
vật hay động vật. Điều khác cơ bản là phải nuôi vi khuẩn để thu sinh khối tế bào và phương pháp
để phá vỡ màng peptidoglycan của vi khuẩn. Có thể sử dụng biện pháp cơ học để phá vỡ thành tế
bào vi khuẩn như nghiền, sóng siêu âm… Người ta cũng có thể enzyme lisozym để phá vỡ màng.
Quy trình tách chiết ADN plasmid
Quy trình bao gồm 6 bước như sau:
- Bước 1: Dịch nuôi cấy vi khuẩn được li tâm ở 5000 vòng/ phút, thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
- Bước 2: Hòa tan cặn bằng dịch thủy giải GET. Sau đó thêm vào 1,5 thể tích Alkaline
SDS (200 mM NaOH và 1% SDS) và ủ hỗn hợp 5p ở nhiệt độ thường. Trung hòa hỗn hợp dung
dịch bằng dung dịch trung hòa (3 mM CH
3
COONa). Lắc đều tuýp cho đến khi xuất hiện màu
trắng đục, đem li tâm và loại bỏ cặn.
- Bước 3: Làm lạnh tuýp và thêm Rnase (3
). Đảo ngược Eppendorf 2-3 lần cho trộn
µ1
đều và ủ nhiệt độ 30
o
C.
- Bước 4: Kết tủa protein bằng hỗn hợp chloroform và phenol.
- Bước 5: Kết tủa ADN bằng ethanol hoặc isopropanol.
- Bước 6: Hòa tan ADN trong dung dịch đệm, kiểm tra và cất giữ.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: