ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
- Điều hướng trang này:
- 2.3.1. Nguyên lí của kỹ thuật PCR
- - Giai đoạn khởi đầu
- Giai đoạn biến tính
- Giai đoạn gắn mồi
| 2.3. Kỹ thuật PCR
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn ADN trong ống nghiệm dựa trên sự mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp của ADN tế bào sống. 2.3.1. Nguyên lí của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp ADN dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase. Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt, liên kết bổ sung với mạch khuôn. Đoạn mồi trong phản ứng PCR là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch ADN khuôn. Thông thường, PCR bao gồm một chuỗi khoảng 20-40 lần biến đổi nhiệt độ lặp đi lặp lại, gọi chu kỳ, mỗi chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt, thường là ba. Các chu kỳ thường bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (>90°C), và sẽ dừng lại khi sản phẩm cuối cùng 8 được tổng hợp hoặc dừng lại ở nhiệt độ thấp để lưu trữ sản phẩm PCR trong thời ngắn. Nhiệt độ và thời gian thực hiện của mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Những yếu tố này gồm enzyme tổng hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong phản ứng, và nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi. - Giai đoạn khởi đầu: (Chỉ cần đối với những enzyme ADN polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ). Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C nếu sử dụng polymerases cực kỳ bền nhiệt) và được tiến hành trong 1-9 phút. - Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt độ lên 94-98°C trong 20-30 giây. ADN được biến tính bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa các bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để mồi gắn vào sợi ADN đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi ADN, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá cao, mồi có thể không gắn. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Liên kết hydro bền giữa phân tử ADN- ADN chỉ được hình thành khi mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn. Polymerase liên kết với các phân tử lai ADN mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp ADN. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|