CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ GEN

- ADN có kích thước lớn, tan trong nước hoặc đệm, kết tủa trắng trong dung môi cồn. Ở
trạng thái kết tủa rất dễ đứt gãy, vì thế mẫu ADN được thường bảo quản ở dạng dung dịch. Nếu
mẫu ADN sử dụng ngay, thường được hòa tan vào nước khử ion. Ngược lại, để bảo quản lâu,
mẫu ADN thường được bảo quản trong đệm TE (Tris – EDTA) nhằm tránh sự nhiễm nuclease.
- Độ sạch của mẫu ADN sau khi tách chiết được xác định theo tỷ lệ giá trị đo huỳnh quang
ở bước sóng A260 và A280. Mẫu ADN được xem là đủ sạch khi tỷ lệ A260/A280
2,0.
≈ 
- ADN được nhìn thấy trong bản gel điện di dưới ánh sáng UV sau khi đã nhuộm ethidium
bromide.
- Phương pháp tách chiết ADN gồm 5 bước chính sau:
+ Bước 1: Phá vỡ thành tế bào bằng biện pháp cơ học enzyme. Ở tế bào thực vật hoặc
động vật, cần có bước tách tế bào ra khỏi mô của chúng.
+ Bước 2: Sử dụng chất tẩy rửa (SDS, hoặc sarcosyl) để phá vỡ lớp phospholipid của
màng tế bào và màng nhân. Trong một số trường hợp, người ta bổ sung thêm protenase K.
+ Bước 3: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,
polysaccharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamyl alcohol tỉ lệ
(25:24:1). Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: Pha trên cùng là pha nước chứa
ADN, ARN; Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa; Pha dưới là dung dịch
phenol: chloroform: isoamyl alcohol.
Việc loại bỏ ARN bằng được thực hiện bằng cách thêm ARNase vào dung dịch hỗn hợp
và ủ khoảng 5 – 10 phút.
+ Bước 4: Kết tủa ADN bằng isopropanol (ở nhiệt độ -20
o
C, khoảng 20 phút) hoặc ethanol
(ở -80
o
C, qua đêm) để loại bỏ hoàn toàn các chất không mong muốn còn hòa tan trong dịch mẫu.
Sau khi ly tâm, loại bỏ dung dịch lỏng chứa tạp chất, ta sẽ thu được cặn ADN kết tủa.
+ Bước 5: Hòa tan cặn ADN bằng nước khử ion hoặc dung dịch đệm TE.
b. Một số quá trình tách chiết ADN ở các đối tượng khác nhau
* Tách chiết ADN động vật
- Có thể tách chiết ADN từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô lông, tóc
(còn nguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác.
- Nguyên tắc chung:
+ Tách tế bào có nhân ra khỏi mô.
+ Phá vỡ màng tế bào, màng nguyên sinh chất và phân hủy protein, giải phóng ADN ra
khỏi nhân.
+ Tách ADN ra khỏi đệm chiết và bảo quản ADN đến -20
o
C.

tải về 1.11 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: