Bài 8 Vi nấm (Microfungi)
tải về 331.22 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- VII. Nước mặn và các vật liệu có trong nước mặn.
- PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP
- 1. Phương pháp dùng kim nhọn
- 2. Phương pháp phân lập bào tử đơn độc
- 3. Phương pháp dùng vi thao tác Skerman
V. Côn trùng.Những côn trùng nhỏ bé, chẳng hạn như amip, giun đất, ve rận, sâu bọ,.... là những mẫu tốt dùng cho phân lập nấm. Đặc biệt là nấm hoại sinh giun tròn (nematode-trapping fungi). VI. Nước ngọt và các vật liệu có trong nước ngọt. Từ mẫu nước ngọt chủ yếu phân lập được 2 nhóm nấm: nhóm thứ nhất là Chytridiomycota, nhóm thứ 2 là các loài nấm ưa nước, ưa nước hiếu khí. Để phân lập nhóm nấm này, nên lấy mẫu nước ngọt và lá rơi ở những ổ sinh thái nước, chẳng hạn như ở sông, suối, ao hồ. Đặc biệt nấm ưa nước dễ dàng bị mắc vào những khúc gỗ mục dưới lòng suối hay đằng sau các hốc đá có dòng nước chảy tạo bọt. VII. Nước mặn và các vật liệu có trong nước mặn.Nấm sợi sống ở nước mặn gọi là nấm sợi ưa mặn, những đặc điểm hình thái và sinh lý của chúng giúp chúng thích nghi được với môi trường mặn. Có 2 nhóm nấm ưa mặn: một loại là ưa mặn bắt buộc (toàn bộ vòng đời của chúng trải qua trong môi trường mặn); loại kia là ưa mặn không bắt buộc (phần lớn có thể phân lập được chúng trong môi trường đất và cả trong môi trường mặn). Để phân lập nấm ưa mặn, ta có thể lấy mẫu từ các cành củi mục, thực vật ưa mặn, thực vật ven biển, từ cát ở bãi biển và từ nước biển, đặc biệt là bọt biển là mẫu rất tốt để phân lập nấm ưa mặn. Tóm lại: Để lấy mẫu phân lập nấm thì bất kỳ loại mẫu nào cũng đều tốt, đều quan trọng, điều chủ yếu vẫn dựa vào mục đích phân lập nhóm nấm nào cần thiết cho công tác nghiên cứu để sự lựa chọn mẫu và phương pháp lấy mẫu. Trên cùng một cơ chất, có thể có nhiều nhóm nấm tồn tại mỗi nhóm lại có một chu kỳ sống khác nhau, nên phân lập ở nhiều thời điểm khác nhau và bằng các phương pháp khác nhau thì có thể phân lập được loài mới hay tìm ra một hệ sinh thái mới của nấm. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP:Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật. Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần. Suy nghĩ một cách sáng tạo cho công việc và thành thạo với các kỹ thuật phân lập mới là yêu cầu chung của bất kỳ một nhà vi sinh vật nào. Các nhà nấm học Nhật Bản thường dùng các phương pháp sau để phân lập nấm sợi: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử (Dr. Chiharu Nakashima); Phân lập bào tử đơn độc (Dr. Chiharu Nakashima); Sử dụng vi thao tác Skerman (Dr. Katsuhiko Ando); Phương pháp pha loãng (Dr. Misa Otoguro); Phân lập từ bào tử đảm (Dr. Chiharu Nakashima); Phương pháp rửa bề mặt (Dr. Katsuhiko Ando); Phương pháp sát khuẩn bề mặt (Dr. Ju-Young Park); Phương pháp dùng buồng kích ẩm (Dr. Katsuhiko Ando); Phương pháp kích thích sự nảy mầm của nấm(Dr. Ju-Young Park); Phương pháp sục khí (Dr. Katsuhiko Ando). Dưới đây chúng tôi xin phép trình bày một số phương pháp hay dùng nhất, đã áp dụng phân lập nấm trong đất, trong lá cây rụng và nấm nội sinh endophyte tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật- Trung tâm công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà nội trong chương trình hợp tác về nghiên cứu đa dạng sinh học với Viện Công nghệ và Đo lường Quốc gia Nhật Bản (NITE- Japan). 1. Phương pháp dùng kim nhọn:Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ một cơ chất nào. Cách làm: 1) Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp. 2) Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất. 3) Khử trùng que nhọn bằng ngọn lửa đèn cồn. 4) Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang môi trường phân lập. 5) Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 250C, quan sát sự nảy mầm của bào tử hàng ngày đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng.
Cách làm: 1) Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử: Dùng kim nhọn đánh bẹt 1 đầu, gắn vào một cái tay cầm chắc chắn, dùng que đó cào vào chỗ trên lá cây bệnh có xuất hiện đốm nấm, đặt sang lam kính đã có sẵn một giọt nước vô trùng, khuấy đềù. 2) Dùng đầu kim lấy một giọt nước có hoà tan bào tử đó vẽ một hình tam giác lên môi trường thạch nước (Water agar). Ủ 200C trong 24 giờ. 3) Quan sát bằng kính hiển vi, tìm bào tử nảy mầm trên môi trường thạch đĩa theo đường viền tam giác trên. Đánh dấu điểm có bào tử nẩy mầm bằng bút viết kính ở mặt dưới đĩa thạch. 4) Chuyển đĩa môi trường thạch có nuôi cấy các bào tử trên sang kính lúp. Quan sát vị trí đánh dấu bào tử nẩy mầm. Thanh trùng que cấy, dùng que cấy lấy bào tử nảy mầm ra, chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy.
Chuẩn bị dụng cụ: Bộ vi thao tác Skerma gồm 5 phần (hình bên). 
1) Lấy một ống pipet pastơ hơ trên ngọn lửa đèn cồn, kéo thành ống rất nhỏ, dài khoảng 4cm, gắn vào ống sắt trên cục nam châm D ( cố định bằng parafin nóng chảy). 2) Cố định phần dụng cụ B vào vật kính 10 3) Gắn nam châm có ống thuỷ tinh vào rãnh kim loại của dụng cụ B. 4) Di chuyển phần thiết bị có gắn cục nam châm lên xuống cho đến khi nhìn thấy đầu ống thuỷ tinh ở giữa vi trường. 5) Gắn đầu kim hàn E vào biến thế A và đặt vào vị trí đặt tiêu bản của kính hiển vi. 6) Chỉnh kính, tìm vi trường, quan sát đầu kim hàn, điều chỉnh sao cho đầu que hàn và ống thuỷ tinh sát nhau và đều quan sát được dưới kính hiển vi. 7) Bật biến thế A nấc cao để đầu que hàn nóng đỏ và tiến về phía ống thuỷ tinh, ấn que hàn chạm vào ống thuỷ tinh để ống thuỷ tinh bắt đầu nóng chảy, kéo nhanh ống thuỷ tinh khỏi kim hàn tạo thành que thuỷ tinh thuôn nhọn. 8) Hạ nhiệt độ que hàn bằng cách giảm biến thế, dùng đầu que hàn chạm nhẹ vào đầu que thuỷ tinh kéo nhẹ tạo thành hình chữ L. Giờ đây ta có thể bắt đầu thực hành lấy từng bào tử đơn độc trên đĩa thạch. Các bước tiến hành: 1) Chuẩn bị mẫu: lá cây khô, cho vào hộp nhựa hoặc túi ni lông có chứa nước vô trùng sẵn để làm ẩm, giữ 2-3 ngày ở nhiệt độ phòng, để kích thích bào tử nẩy mầm. 2) Lấy mẫu lá trên cho vào cốc thuỷ tinh, cho thêm nước cất, khuấy nhẹ nhàng cho bào tử nổi lên mặt nước. 3) Thu thập bào tử bằng cách lấy lam kính để nghiêng 450 so với mặt nước để lấy nước trên bề mặt cốc. Dùng lam kính đó trải một đường thẳng trên mặt đĩa môi trường phân lập nấm LCA (Low cacbon agar), MEA (Malt extract agar). 4) Quan sát đĩa thạch trên dưới kính hiển vi, tìm bào tử có hình dạng đặc biệt. Khi thấy bào tử cần tìm thì giữ nguyên vị trí. 5) Gắn phần dụng cụ hình chữ V (hình C) của bộ vi thao tác vào vật kính 10 của kính hiển vi. Tiếp đến gắn phần nam châm có que thuỷ tinh hình chữ L vừa làm xong vào phần dụng cụ chữ V đó. Điều chỉnh lên xuống sao cho có thể quan sát được đầu chữ L của que thuỷ tinh. 6) Nâng kính lên sao cho bề mặt thạch sát với đầu que thuỷ tinh, lúc này ta có thể quan sát được cả bào tử nấm cần tìm và cả đầu L của que thuỷ tinh. 7) Dùng que L kéo bào tử cần lấy ra phần môi trường sạch của đĩa thạch. Dùng chính kim phần chữ L đó đánh dấu điểm đặt bào tử. 8) Hạ đĩa môi trường thấp xuống và dùng que cấy vô trùng lấy bào tử tại điểm đánh dấu chuyển sang đĩa thạch môi trường MEA. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và quan sát sự nảy mầm của bào tử hàng ngày. Nếu bào tử nảy mầm thì có thể chuyển sang thạch nghiêng để giữ giống sau khi để ở thạch đĩa 2-4 tuần. tải về 331.22 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|