Xanthomonas oryzea pv oryze, đ
Bảng 2: Danh sách mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
tải về 2.53 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Các bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian
- Tần số allele phổ biến nhất
- III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR
Bảng 2: Danh sách mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết ADN: ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp "NaOH extraction" của Wang (1993) [19]. Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước: Mẫu lá non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml. Thêm 200µl NaOH 0.25N. Nghiền mịn mẫu lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM 200. Thêm 800µl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trộn đều. Ly tâm 12.000vòng/phút trong 20 phút. Chuyển 200µl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml. Lưu giữ ở - 200C để làm dung dịch ADN gốc. Pha loãng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5µl dung dịch ADN pha loãng cho mỗi phản ứng PCR - Kỹ thuật PCR: Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 well Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: 5µl AND; 0.15µM mồi; 0.2 mM dNTPs; 1X dịch đệm PCR; 2.5mM MgCl2 và 0.25 đơn vị Taq TaKaRa. Điều kiện phản ứng PCR:
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 3%. - Phương pháp điện di trên gel agarose Theo phương pháp của Khoa Genome Thực vật, Trường Đại học Công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến. Chuẩn bị gel agarose: - Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng độ 3.0%. - Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng. - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C. - Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lược. - Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút. - Tra sản phẩm PCR. - Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ. - Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh. - Phân tích số liệu: Những số liệu thống kê bao gồm số allele trên locus, tần số allele phổ biến nhất, số allele độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó: - Chỉ số Tần số allele phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể xuất hiện allele phổ biến nhất trên tổng số allele xuất hiện ở từng locus nghiên cứu - Allele độc nhất của từng chỉ thị SSR được xác định là allele xuất hiện duy nhất ở 1 giống trong toàn bộ các giống lúa nghiên cứu. - Đa dạng di truyền allele của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình: 
Trong đó: Pij : là tần số xuất hiện của allele thứ j tương ứng với mồi i. Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, càng nhiều allele được sinh ra. Sự có mặt hay vắng mặt của các allele của từng chỉ thị SSR được ghi nhận cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí. Số liệu được tổng hợp và xử lý thông qua chương trình NTSYS-pc v. 2.1 [17], xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice [14], tiếp theo là sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tổng số 50 chỉ thị SSR để khảo sát đa hình với một số giống lúa đại diện, kết quả thu được 28 chỉ thị cho đa hình, số chỉ thị này tiếp tục được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền của toàn bộ 38 giống lúa nghiên cứu số chỉ thị còn lại (22 chỉ thị) không cho đa hình giữa các giống, kết quả điện di cho thấy sản phẩm mờ hoặc không cho sản phẩm PCR, nên đã loại bỏ khỏi nghiên cứu này. Dưới đây là một số ảnh minh hoạ kết quả điện di sản phẩm PCR của 38 giống lúa nghiên cứu với các chỉ thị SSR trên gel agarose 3,0%. (Hình 1) 
Каталог: phenotype -> upload -> article article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7) article -> MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ article -> Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5) article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3 article -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4 article -> Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng article -> ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa tải về 2.53 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||