TuyÓn tËp tiªu chuÈn phn bãn Nhãm B



tải về 61.53 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu17.08.2016
Kích61.53 Kb.

tuyÓn tËp tiªu chuÈn ph©n bãn

Nhãm B


Tiªu chuÈn ngµnh 10 TCN 445-2001



Ph­¬ng ph¸p kiÓm tra

Ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬ vµ ph©n gi¶i xenlulo


Anaerobic nitrogen fixing and cellulotic degradating biofertylizer


Method for quality control



1. Ph¹m vi ¸p dông:

Tiªu chuÈn nµy ¸p dông cho viÖc kiÓm tra mËt ®é c¸c vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng cè ®Þnh nit¬ hoÆc ph©n gi¶i xenlulo kÞ khÝ trong ph©n bãn vi sinh vËt.



2. ThuËt ng÷, ®Þnh nghÜa:

2.1. Ph©n vi sinh vËt (gäi t¾t lµ ph©n vi sinh) lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt sèng h÷u Ých ®· ®­îc tuyÓn chän cã mËt ®é ®¹t theo tiªu chuÈn hiÖn hµnh th«ng qua c¸c ho¹t ®éng sèng cña chóng trong ®Êt t¹o nªn chÊt dinh d­ìng mµ c©y trång cã thÓ sö dông ®­îc (N, P, K) hay c¸c ho¹t chÊt sinh häc, gãp phÇn n©ng cao n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng n«ng s¶n. Ph©n vi sinh vËt kh«ng g©y ¶nh h­ëng xÊu ®Õn chÊt l­îng n«ng s¶n, ng­êi, ®éng vËt, thùc vËt vµ m«i tr­êng sinh th¸i.

2.2. Ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬ lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt sèng, ®· ®­îc tuyÓn chän víi mËt ®é ®¹t theo tiªu chuÈn hiÖn hµnh, cã kh¶ n¨ng cè ®Þnh nit¬ trong ®iÒu kiÖn kÞ khÝ, t¹o ®iÒu kiÖn n©ng cao n¨ng suÊt hoÆc chÊt l­îng s¶n phÈm. C¸c chñng vi sinh vËt nµy kh«ng ¶nh h­ëng xÊu ®Õn ng­êi, ®éng vËt, thùc vËt, m«i tr­êng sinh th¸i vµ chÊt l­îng n«ng s¶n.

2.3. Ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ ph©n gi¶i xenlulo lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt sèng, ®· ®­îc tuyÓn chän víi mËt ®é ®¹t theo tiªu chuÈn hiÖn hµnh, cã kh¶ n¨ng ph©n gi¶i xenlulo trong ®iÒu kiÖn kÞ khÝ, t¹o ®iÒu kiÖn n©ng cao n¨ng suÊt hoÆc chÊt l­îng s¶n phÈm. C¸c chñng vi sinh vËt nµy kh«ng ¶nh h­ëng xÊu ®Õn ng­êi, ®éng vËt, thùc vËt, m«i tr­êng sinh th¸i vµ chÊt l­îng n«ng s¶n.

2.4. Vi sinh vËt ®· ®­îc tuyÓn chän lµ vi sinh vËt ®· ®­îc nghiªn cøu, ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc vµ hiÖu qu¶ ®èi víi ®Êt, c©y trång dïng ®Ó s¶n xuÊt ph©n vi sinh vËt.

2.5. Vi sinh vËt t¹p lµ vi sinh vËt cã s½n trong ph©n vi sinh vËt nh­ng kh«ng thuéc lo¹i vi sinh vËt ®· ®­îc tuyÓn chän.



3. Néi dung, ph­¬ng ph¸p:

3.1. Trang thiÕt bÞ:




  • Tñ sÊy (thiÕt bÞ tiÖt trïng kh«) vµ nåi hÊp ¸p lùc (thiÕt bÞ tiÖt trïng ­ít)

  • Tñ Êm

  • Tñ cÊy v« trïng

  • C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g

  • Que cÊy

  • Que g¹t thñy tinh

  • èng nghiÖm thñy tinh

  • èng ®ong

  • B×nh tam gi¸c

  • §Üa petri (hép lång)

  • Pipet chia ®é, pipetman

  • §Ìn cån hoÆc ®Ìn gas

  • Dông cô lÊy mÉu ph¶i lµ lo¹i thÐp kh«ng gØ hoÆc b»ng thuû tinh.

  • Dông cô nu«i cÊy kÞ khÝ: cã thÓ sö dông mét trong c¸c dông cô sau:

+ Tñ nu«i kÞ khÝ

+ B×nh ch©n kh«ng

+ B×nh nu«i kÞ khÝ: Gas Pak

3.2. TiÕn hµnh:

3.2.1. ChuÈn bÞ dông cô:

C¸c dông cô lÊy mÉu vµ dông cô dïng trong x¸c ®Þnh vi sinh vËt ph¶i tiÖt trïng b»ng mét trong c¸c ph­¬ng ph¸p d­íi ®©y:



  • Trong tñ sÊy ë nhiÖt ®é 160 - 1750C kh«ng Ýt h¬n 2 giê.

  • Trong nåi hÊp ¸p lùc 1 at (1210C) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.

3.2.2. ChuÈn bÞ m«i tr­êng:

3.2.2.1.M«i tr­êng dïng ®Ó kiÓm tra ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬, ph©n gi¶i xenlulo phô thuéc vµo chñng lo¹i vi sinh vËt mµ nhµ s¶n xuÊt sö dông. NÕu kh«ng cã yªu cÇu cña nhµ s¶n xuÊt, khi kiÓm tra sö dông m«i tr­êng ( phô lôc kÌm theo).

M«i tr­êng ®­îc pha chÕ theo thø tù c¸c ho¸ chÊt trong thµnh phÇn ®· cho. Sau ®ã ph©n phèi vµo c¸c dông cô thuû tinh ®· chuÈn bÞ tr­íc råi khö trïng ë nh÷ng ®iÒu kiÖn phï hîp. §Ó nguéi m«i tr­êng ®Õn 45-500C råi ph©n phèi vµo c¸c ®Üa petri v« trïng. Thao t¸c nµy ®­îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn v« trïng. KiÓm tra ®é s¹ch cña m«i tr­êng sau 2 ngµy ë nhiÖt ®é tõ 28 ®Õn 300C. ChØ sö dông c¸c ®Üa petri chøa c¸c m«i tr­êng nu«i cÊy vi sinh vËt kh«ng ph¸t hiÖn thÊy t¹p nhiÔm.

3.2.2.2. DÞch pha lo·ng lµ n­íc muèi sinh lý (NaCl 0,85%), kh«ng chøa c¸c hîp chÊt nit¬, sau khi khö trïng cã ®é pH lµ 7,0.

Ph©n phèi dÞch pha lo·ng vµo c¸c èng nghiÖm, b×nh tam gi¸c cã dung tÝch thÝch hîp víi mét l­îng sao cho sau khi khö trïng, mçi èng nghiÖm chøa 9ml, mçi b×nh tam gi¸c chøa 90ml. Lµm nót b«ng vµ khö trïng ë 1 at (1210C) trong 30 phót.

NÕu ch­a sö dông ngay, dÞch pha lo·ng cÇn ®­îc b¶o qu¶n trong tñ l¹nh ë nhiÖt ®é 4-100C, thêi gian b¶o qu¶n kh«ng qu¸ 1 th¸ng kÓ tõ ngµy chuÈn bÞ.



Ghi chó: §Ó tr¸nh lµm ¶nh h­ëng ®Õn c¸c vi sinh vËt do thay ®æi nhiÖt ®é ®ét ngét, nªn ®iÒu chØnh nhiÖt ®é cña dÞch pha lo·ng ®Õn nhiÖt ®é phßng thö nghiÖm tr­íc khi sö dông.

3.2.3. LÊy mÉu:

3.2.3.1. Qui ®Þnh chung:

ViÖc lÊy mÉu ®­îc tiÕn hµnh sao cho mÉu kiÓm tra ph¶i lµ mÉu ®¹i diÖn cho c¶ l« hµng. Ng­êi lÊy mÉu ph¶i ®­îc huÊn luyÖn vµ cã kinh nghiÖm trong viÖc lÊy mÉu.

Trong qu¸ tr×nh lÊy mÉu, vËn chuyÓn vµ xö lý mÉu, ph¶i ®¶m b¶o tr¸nh sù l©y nhiÔm tõ bªn ngoµi vµ ph¶i ®¶m b¶o lµ mÉu ph¶i ®­îc gi÷ nguyªn tr¹ng nh­ ban ®Çu cho tíi khi ®em ph©n tÝch trong phßng thÝ nghiÖm.

Kh«ng ®­îc bæ sung thªm bÊt cø mét t¸c nh©n b¶o qu¶n, diÖt khuÈn hoÆc diÖt nÊm nµo vµo mÉu kiÓm tra.

MÉu ®­îc lÊy ph¶i tõ c¸c bao nguyªn gãi.

Ph¶i tiÕn hµnh lÊy mÉu ë nh÷ng n¬i kh«ng cã h¬i n­íc nãng, ho¸ chÊt ®éc h¹i, kh«ng cã ¸nh n¾ng gay g¾t hoÆc bôi vµ ®­îc ®­a ngay vµo dông cô chøa mÉu.

C¸c dông cô lÊy mÉu vµ chøa mÉu ph¶i v« trïng.

3.2.3.2. Sè l­îng mÉu:

L« hµng bao gåm c¸c bao (tói) ®­îc s¶n xuÊt cïng mét ®ît víi cïng mét nguån nguyªn liÖu.

Sè l­îng bao (tói) cÇn lÊy ®Ó kiÓm tra ®èi víi mçi l« hµng phô thuéc vµo ®é lín cña l« hµng ®ã vµ phï hîp víi qui ®Þnh trong b¶ng 1


B¶ng 1: Sè l­îng bao (tói) cÇn lÊy ®Ó kiÓm tra


C¶ l« hµng (bao, tói)

Sè l­îng mÉu cÇn lÊy (bao, tói)

§Õn 100

Tõ 101 ®Õn 1000

Tõ 1001 ®Õn 10000

Lín h¬n 10000



7

11

15



19

C¸c bao (tói) mÉu ®­îc lùa chän ngÉu nhiªn theo TCVN 1964-75

TiÕn hµnh lÊy mÉu trung b×nh tõ mÉu chung lµ tËp hîp c¸c mÉu ban ®Çu trong l« hµng kiÓm tra. Chia mÉu trung b×nh lµm 2 phÇn b»ng nhau råi bao gãi phï hîp víi yªu cÇu cña s¶n phÈm. Mét phÇn dïng ®Ó kiÓm tra vµ mét phÇn ®Ó l­u vµ b¶o qu¶n trong ®iÒu kiÖn qui ®Þnh mµ mçi lo¹i s¶n phÈm yªu cÇu ®Ó dïng khi ph©n tÝch träng tµi. Trªn mçi gãi mÉu ph¶i cã nh·n ghi râ:

Tªn mÉu vµ ®èi t­îng c©y trång ®­îc sö dông

Tªn c¬ së s¶n xuÊt

Thêi gian s¶n xuÊt

Thêi gian vµ ®Þa ®iÓm lÊy mÉu

Tªn ng­êi lÊy mÉu, c¬ quan lÊy mÉu.

3.2.4. KiÓm tra:

3.2.4.1. MËt ®é vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬:

3.2.4.1.1. Pha lo·ng mÉu:

a) §èi víi mÉu d¹ng láng: Dïng pipet v« trïng lÊy 10ml mÉu cho vµo 90ml dÞch pha lo·ng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.2.2.2), tr¸nh ch¹m pipet vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-10 gi©y. Dung dÞch t¹o ra ®­îc gäi lµ dung dÞch huyÒn phï ban ®Çu.

b) §èi víi mÉu d¹ng bét: C©n 10g mÉu cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g vµ cho vµo 90ml dÞch pha lo·ng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.2.2.2). Trén kü b»ng dông cô trén c¬ häc tõ 5 ®Õn 10 phót sao cho cã ®­îc mét dung dÞch cã ph©n bè ®ång ®Òu, ®Ó l¾ng c¸c phÇn tö nÆng trong kho¶ng 15 phót, g¹n ®­îc dung dÞch huyÒn phï ban ®Çu.

c) Dïng pipet ®· v« trïng hót 1ml dÞch huyÒn phï ban ®Çu (a hoÆc b) cho vµo 9 ml dÞch pha lo·ng, tr¸nh ch¹m pipet vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-10 gi©y, ®Ó cã dÞch pha lo·ng mÉu cã nång ®é lµ 10-2. LÆp l¹i c¸c thao t¸c nµy ®Ó thu ®­îc dÞch pha lo·ng ®èi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang khö trïng lµ 10-5, 10-6, 10 -7 vµ ®èi víi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang kh«ng khö trïng lµ 10-3, 10-4 vµ 10-5.

3.2.4.1. 2. CÊy mÉu:

Dïng pipet v« trïng lÊy tõ dÞch mÉu pha lo·ng 10-5, 10-6, 10-7 ®èi víi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang khö trïng vµ 10-3, 10-4, 10-5 ®èi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang kh«ng khö trïng mét l­îng dÞch lµ 0,05 ml (1 giät) cÊy vµo 1 ®Üa petri chøa m«i tr­êng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.2.2.1). Mçi mÉu pha lo·ng ®­îc cÊy lÆp l¹i trªn 3 ®Üa petri.

Dïng que g¹t v« trïng g¹t ®Òu dÞch mÉu trªn bÒ mÆt th¹ch, ®îi kh« vµ óp ng­îc hép petri sau ®ã ®­a vµo nu«i ë ®iÒu kiÖn kÞ khÝ (*) trong thêi gian vµ nhiÖt ®é thÝch hîp víi tõng lo¹i vi sinh vËt.

§Õm sè l­îng khuÈn l¹c ®Æc tr­ng cña mÉu gièng vi sinh vËt trªn mçi ®Üa petri.

MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra (ml) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau:



Trong ®ã:

A: MËt ®é vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ trªn ®¬n vÞ kiÓm tra (g hoÆc ml)

a: sè khuÈn l¹c trung b×nh cã trong ®Üa petri

d: nång ®é dÞch pha lo·ng

Ghi chó: Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh ®­îc tÝnh lµ trung b×nh céng sè khuÈn l¹c cña c¸c ®Üa petri ®­îc cÊy tõ cïng mét ®é pha lo·ng, trong ®ã chØ tÝnh c¸c ®Üa petri chøa tõ 5-50 khuÈn l¹c. Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh còng cã thÓ ®­îc tÝnh lµ trung b×nh.

Céng sè l­îng khuÈn l¹c cña c¸c ®Üa petri ®­îc cÊy tõ hai ®é pha lo·ng kÕ tiÕp nhau b»ng c¸ch tÝnh sè khuÈn l¹c trung b×nh céng ë mçi ®é pha lo·ng, trong ®ã sè khuÈn l¹c ë ®é pha lo·ng cao h¬n ®­îc nh©n víi 10, sau ®ã lÊy trung b×nh céng cña hai gi¸ trÞ trªn nÕu tû sè gi÷a gi¸ trÞ lín vµ gi¸ trÞ nhá kh«ng lín h¬n 2. NÕu tû sè nµy lín h¬n 2 th× lÊy gi¸ trÞ nhá lµm kÕt qu¶. MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra ®­îc biÓu thÞ b»ng mét sè gi÷a 1,00 vµ 9,99 nh©n víi 10n, n lµ sè mò thÝch hîp.

(*): Cã thÓ sö dông mét trong c¸c ph­¬ng ph¸p t¹o ®iÒu kiÖn kÞ khÝ sau:

- Lo¹i bá «xy b»ng ph­¬ng ph¸p vËt lÝ:

+ Tñ nu«i kÞ khÝ hoÆc

+ B×nh hót Èm cã vßi hót ch©n kh«ng, hµn kÝn b»ng vad¬lin, kh«ng khÝ trong b×nh ®­îc hót ra vµ thay b»ng hçn hîp khÝ CO2, N2, H2 (b×nh ch©n kh«ng). §Ó lo¹i bá «xy mét c¸ch triÖt ®Ó, tr­íc ®ã nªn ®Æt vµo trong b×nh c¸c cèc ®ùng chÊt hÊp thô «xy nh­ dithionit, clorua ®ång, iot... Cã thÓ lµm gi¶m t¸c dông cña «xy b»ng c¸ch thªm vµo m«i tr­êng dinh d­ìng c¸c chÊt khö «xy nh­ axit thioglycolic (0,3 ml/l) vµ systein (0,75 g/l).

- Lo¹i bá «xy trong kh«ng khÝ b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc:

+ B×nh nu«i kÞ khÝ Gas Pak.

+ Sö dông dung dÞch xanh metylen-NaOH-glucoza: Trén ®Òu 3 dung dÞch víi 1 l­îng b»ng nhau (6ml NaOH 10N trong 100ml n­íc cÊt; 3,0ml xanh metylen 5% trong 100ml n­íc cÊt vµ 6g glucoza trong 100ml n­íc cÊt cã bæ sung mét chót thymol kÕt tinh) råi cho vµo èng nghiÖm vµ ®un c¸ch thuû ®Õn mÊt mµu. §Æt èng chØ thÞ nµy vµo thiÕt bÞ nu«i cÊy kÝn. èng chØ thÞ sÏ t¹o ra t×nh tr¹ng yÕm khÝ trong thiÕt bÞ («xy ®­îc khö hoµn toµn khi mµu xanh cña dung dÞch chØ thÞ bÞ biÕn mÊt vµ kh«ng t¸i hiÖn trë l¹i).

- Nu«i cÊy trong m«i tr­êng lµm ngËp kÐp: DÞch pha lo·ng mÉu ®­îc trén víi m«i tr­êng th¹ch dinh d­ìng phï hîp víi tõng lo¹i vi sinh vËt sau khi khö trïng ®· ®Ó nguéi ®Õn 40 - 450C vµ ®æ vµo ®Üa petri. Sau khi th¹ch ®«ng ®æ thªm mét líp th¹ch - n­íc v« trïng (nguéi ®Õn 40 - 450C). ñ c¸c ®Üa th¹ch ë nhiÖt ®é thÝch hîp.

3.2.4.2. KiÓm tra mËt ®é vi sinh vËt kÞ khÝ ph©n gi¶i xenlulo:

3.2.4.2.1. Pha lo·ng mÉu:

Xem 3.2.4.1.1

3.2.4.2.2. CÊy mÉu:

Xem 3.2.4.1.2

- Ph¸t hiÖn vßng ph©n gi¶i: Sau khi khuÈn l¹c vi sinh vËt ®· ph¸t triÓn trªn ®Üa petri chøa m«i tr­êng kiÓm tra, ®Ó ®Üa petri vµo tñ l¹nh trong 12 giê. Sau ®ã cho vµo tñ Êm 400C trong 6 giê. LÊy ra, cho vµo mçi ®Üa petri 5ml thuèc thö lugon, tr¸ng ®Òu kh¾p mÆt th¹ch, ®Ó trong 15 phót råi g¹n bá hÕt thuèc thö lugon ®i. §Õm sè khuÈn l¹c trong ®Üa petri t¹o vßng ph©n gi¶i (vßng trong suèt) bao quanh khuÈn l¹c.

- TÝnh to¸n kÕt qu¶: xem 3.2.4.1.2


Phô lôc


I. M«i tr­êng kiÓm tra vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ kÞ khÝ:



1. M«i tr­êng 1:

N­íc cÊt 1000ml

Glucoza 20,0g

K2HPO4 1,0g

MgSO4.7H2O 0,5g

NaCl vÕt


FeSO4.7H2O vÕt

MnSO4.5H2O vÕt

CaCO3 40,0g

axit ascobic 1,0g

E.D.T.A. (Trilon B) 1,0g

Th¹ch bét 15,0g


2. M«i tr­êng2:

N­íc chiÕt khoai t©y(*) 1000ml

Glucoza 20,0g

K2HPO4 0,2g

MgSO4.7H2O 0,2g

Axit ascobic 1,0g

CaCO3 3,0g

Th¹ch bét 15,0g

(*) N­íc chiÕt khoai t©y: Khoai t©y: 200,0g

N­íc cÊt: 500ml

Khoai t©y gät vá, c¾t nhá, ®un s«i trong 15 phót, läc trong, bæ sung ®ñ

1000ml

II. M«i tr­êng kiÓm tra vi sinh vËt ph©n gi¶i xenlulo kÞ khÝ:

1. M«i tr­êng3:

N­íc m¸y 1000ml

NaNH4HPO4 1,5g

KH2PO4 0,5g

NaCl 0,1g

K2HPO4 0,5g

MgSO4.7H2O 0,4g

Pepton 5,0g

CaCO3 2,0g

Dung dÞch MnSO4.5H2O 1% 1 giät

Dung dÞch FeSO4.7H2O 1% 1 giät

CMC 20,0g

Th¹ch bét 15,0g

pH: 7,0-7,4



2. M«i tr­êng 4:

N­íc m¸y 500ml

N­íc thÞt-pepton 500ml

CaCO3 2,0g

CMC 15,0g

Th¹ch bét 15,0g

pH: 7,0-7,4

3. M«i tr­êng 5:

N­íc m¸y 900ml

N­íc chiÕt nÊm men 100ml

Glucoza 0,5g

Pepton 5,0g

CMC 3,0g


Th¹ch bét 15,0g

pH: 7,4




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2016
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương