tuyÓn tËp tiªu chuÈn ph©n bãn
Nhãm B
Tiªu chuÈn ngµnh 10 TCN 445-2001
|
Ph¬ng ph¸p kiÓm tra
Ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬ vµ ph©n gi¶i xenlulo
Anaerobic nitrogen fixing and cellulotic degradating biofertylizer
Method for quality control
|
1. Ph¹m vi ¸p dông:
Tiªu chuÈn nµy ¸p dông cho viÖc kiÓm tra mËt ®é c¸c vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng cè ®Þnh nit¬ hoÆc ph©n gi¶i xenlulo kÞ khÝ trong ph©n bãn vi sinh vËt.
2. ThuËt ng÷, ®Þnh nghÜa:
2.1. Ph©n vi sinh vËt (gäi t¾t lµ ph©n vi sinh) lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt sèng h÷u Ých ®· ®îc tuyÓn chän cã mËt ®é ®¹t theo tiªu chuÈn hiÖn hµnh th«ng qua c¸c ho¹t ®éng sèng cña chóng trong ®Êt t¹o nªn chÊt dinh dìng mµ c©y trång cã thÓ sö dông ®îc (N, P, K) hay c¸c ho¹t chÊt sinh häc, gãp phÇn n©ng cao n¨ng suÊt vµ chÊt lîng n«ng s¶n. Ph©n vi sinh vËt kh«ng g©y ¶nh hëng xÊu ®Õn chÊt lîng n«ng s¶n, ngêi, ®éng vËt, thùc vËt vµ m«i trêng sinh th¸i.
2.2. Ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬ lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt sèng, ®· ®îc tuyÓn chän víi mËt ®é ®¹t theo tiªu chuÈn hiÖn hµnh, cã kh¶ n¨ng cè ®Þnh nit¬ trong ®iÒu kiÖn kÞ khÝ, t¹o ®iÒu kiÖn n©ng cao n¨ng suÊt hoÆc chÊt lîng s¶n phÈm. C¸c chñng vi sinh vËt nµy kh«ng ¶nh hëng xÊu ®Õn ngêi, ®éng vËt, thùc vËt, m«i trêng sinh th¸i vµ chÊt lîng n«ng s¶n.
2.3. Ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ ph©n gi¶i xenlulo lµ s¶n phÈm chøa mét hay nhiÒu chñng vi sinh vËt sèng, ®· ®îc tuyÓn chän víi mËt ®é ®¹t theo tiªu chuÈn hiÖn hµnh, cã kh¶ n¨ng ph©n gi¶i xenlulo trong ®iÒu kiÖn kÞ khÝ, t¹o ®iÒu kiÖn n©ng cao n¨ng suÊt hoÆc chÊt lîng s¶n phÈm. C¸c chñng vi sinh vËt nµy kh«ng ¶nh hëng xÊu ®Õn ngêi, ®éng vËt, thùc vËt, m«i trêng sinh th¸i vµ chÊt lîng n«ng s¶n.
2.4. Vi sinh vËt ®· ®îc tuyÓn chän lµ vi sinh vËt ®· ®îc nghiªn cøu, ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc vµ hiÖu qu¶ ®èi víi ®Êt, c©y trång dïng ®Ó s¶n xuÊt ph©n vi sinh vËt.
2.5. Vi sinh vËt t¹p lµ vi sinh vËt cã s½n trong ph©n vi sinh vËt nhng kh«ng thuéc lo¹i vi sinh vËt ®· ®îc tuyÓn chän.
3. Néi dung, ph¬ng ph¸p:
3.1. Trang thiÕt bÞ:
-
Tñ sÊy (thiÕt bÞ tiÖt trïng kh«) vµ nåi hÊp ¸p lùc (thiÕt bÞ tiÖt trïng ít)
-
Tñ Êm
-
Tñ cÊy v« trïng
-
C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g
-
Que cÊy
-
Que g¹t thñy tinh
-
èng nghiÖm thñy tinh
-
èng ®ong
-
B×nh tam gi¸c
-
§Üa petri (hép lång)
-
Pipet chia ®é, pipetman
-
§Ìn cån hoÆc ®Ìn gas
-
Dông cô lÊy mÉu ph¶i lµ lo¹i thÐp kh«ng gØ hoÆc b»ng thuû tinh.
-
Dông cô nu«i cÊy kÞ khÝ: cã thÓ sö dông mét trong c¸c dông cô sau:
+ Tñ nu«i kÞ khÝ
+ B×nh ch©n kh«ng
+ B×nh nu«i kÞ khÝ: Gas Pak
3.2. TiÕn hµnh:
3.2.1. ChuÈn bÞ dông cô:
C¸c dông cô lÊy mÉu vµ dông cô dïng trong x¸c ®Þnh vi sinh vËt ph¶i tiÖt trïng b»ng mét trong c¸c ph¬ng ph¸p díi ®©y:
-
Trong tñ sÊy ë nhiÖt ®é 160 - 1750C kh«ng Ýt h¬n 2 giê.
-
Trong nåi hÊp ¸p lùc 1 at (1210C) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.
3.2.2. ChuÈn bÞ m«i trêng:
3.2.2.1.M«i trêng dïng ®Ó kiÓm tra ph©n vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬, ph©n gi¶i xenlulo phô thuéc vµo chñng lo¹i vi sinh vËt mµ nhµ s¶n xuÊt sö dông. NÕu kh«ng cã yªu cÇu cña nhµ s¶n xuÊt, khi kiÓm tra sö dông m«i trêng ( phô lôc kÌm theo).
M«i trêng ®îc pha chÕ theo thø tù c¸c ho¸ chÊt trong thµnh phÇn ®· cho. Sau ®ã ph©n phèi vµo c¸c dông cô thuû tinh ®· chuÈn bÞ tríc råi khö trïng ë nh÷ng ®iÒu kiÖn phï hîp. §Ó nguéi m«i trêng ®Õn 45-500C råi ph©n phèi vµo c¸c ®Üa petri v« trïng. Thao t¸c nµy ®îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn v« trïng. KiÓm tra ®é s¹ch cña m«i trêng sau 2 ngµy ë nhiÖt ®é tõ 28 ®Õn 300C. ChØ sö dông c¸c ®Üa petri chøa c¸c m«i trêng nu«i cÊy vi sinh vËt kh«ng ph¸t hiÖn thÊy t¹p nhiÔm.
3.2.2.2. DÞch pha lo·ng lµ níc muèi sinh lý (NaCl 0,85%), kh«ng chøa c¸c hîp chÊt nit¬, sau khi khö trïng cã ®é pH lµ 7,0.
Ph©n phèi dÞch pha lo·ng vµo c¸c èng nghiÖm, b×nh tam gi¸c cã dung tÝch thÝch hîp víi mét lîng sao cho sau khi khö trïng, mçi èng nghiÖm chøa 9ml, mçi b×nh tam gi¸c chøa 90ml. Lµm nót b«ng vµ khö trïng ë 1 at (1210C) trong 30 phót.
NÕu cha sö dông ngay, dÞch pha lo·ng cÇn ®îc b¶o qu¶n trong tñ l¹nh ë nhiÖt ®é 4-100C, thêi gian b¶o qu¶n kh«ng qu¸ 1 th¸ng kÓ tõ ngµy chuÈn bÞ.
Ghi chó: §Ó tr¸nh lµm ¶nh hëng ®Õn c¸c vi sinh vËt do thay ®æi nhiÖt ®é ®ét ngét, nªn ®iÒu chØnh nhiÖt ®é cña dÞch pha lo·ng ®Õn nhiÖt ®é phßng thö nghiÖm tríc khi sö dông.
3.2.3. LÊy mÉu:
3.2.3.1. Qui ®Þnh chung:
ViÖc lÊy mÉu ®îc tiÕn hµnh sao cho mÉu kiÓm tra ph¶i lµ mÉu ®¹i diÖn cho c¶ l« hµng. Ngêi lÊy mÉu ph¶i ®îc huÊn luyÖn vµ cã kinh nghiÖm trong viÖc lÊy mÉu.
Trong qu¸ tr×nh lÊy mÉu, vËn chuyÓn vµ xö lý mÉu, ph¶i ®¶m b¶o tr¸nh sù l©y nhiÔm tõ bªn ngoµi vµ ph¶i ®¶m b¶o lµ mÉu ph¶i ®îc gi÷ nguyªn tr¹ng nh ban ®Çu cho tíi khi ®em ph©n tÝch trong phßng thÝ nghiÖm.
Kh«ng ®îc bæ sung thªm bÊt cø mét t¸c nh©n b¶o qu¶n, diÖt khuÈn hoÆc diÖt nÊm nµo vµo mÉu kiÓm tra.
MÉu ®îc lÊy ph¶i tõ c¸c bao nguyªn gãi.
Ph¶i tiÕn hµnh lÊy mÉu ë nh÷ng n¬i kh«ng cã h¬i níc nãng, ho¸ chÊt ®éc h¹i, kh«ng cã ¸nh n¾ng gay g¾t hoÆc bôi vµ ®îc ®a ngay vµo dông cô chøa mÉu.
C¸c dông cô lÊy mÉu vµ chøa mÉu ph¶i v« trïng.
3.2.3.2. Sè lîng mÉu:
L« hµng bao gåm c¸c bao (tói) ®îc s¶n xuÊt cïng mét ®ît víi cïng mét nguån nguyªn liÖu.
Sè lîng bao (tói) cÇn lÊy ®Ó kiÓm tra ®èi víi mçi l« hµng phô thuéc vµo ®é lín cña l« hµng ®ã vµ phï hîp víi qui ®Þnh trong b¶ng 1
B¶ng 1: Sè lîng bao (tói) cÇn lÊy ®Ó kiÓm tra -
C¶ l« hµng (bao, tói)
|
Sè lîng mÉu cÇn lÊy (bao, tói)
|
§Õn 100
Tõ 101 ®Õn 1000
Tõ 1001 ®Õn 10000
Lín h¬n 10000
|
7
11
15
19
|
C¸c bao (tói) mÉu ®îc lùa chän ngÉu nhiªn theo TCVN 1964-75
TiÕn hµnh lÊy mÉu trung b×nh tõ mÉu chung lµ tËp hîp c¸c mÉu ban ®Çu trong l« hµng kiÓm tra. Chia mÉu trung b×nh lµm 2 phÇn b»ng nhau råi bao gãi phï hîp víi yªu cÇu cña s¶n phÈm. Mét phÇn dïng ®Ó kiÓm tra vµ mét phÇn ®Ó lu vµ b¶o qu¶n trong ®iÒu kiÖn qui ®Þnh mµ mçi lo¹i s¶n phÈm yªu cÇu ®Ó dïng khi ph©n tÝch träng tµi. Trªn mçi gãi mÉu ph¶i cã nh·n ghi râ:
Tªn mÉu vµ ®èi tîng c©y trång ®îc sö dông
Tªn c¬ së s¶n xuÊt
Thêi gian s¶n xuÊt
Thêi gian vµ ®Þa ®iÓm lÊy mÉu
Tªn ngêi lÊy mÉu, c¬ quan lÊy mÉu.
3.2.4. KiÓm tra:
3.2.4.1. MËt ®é vi sinh vËt kÞ khÝ cè ®Þnh nit¬:
3.2.4.1.1. Pha lo·ng mÉu:
a) §èi víi mÉu d¹ng láng: Dïng pipet v« trïng lÊy 10ml mÉu cho vµo 90ml dÞch pha lo·ng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.2.2.2), tr¸nh ch¹m pipet vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-10 gi©y. Dung dÞch t¹o ra ®îc gäi lµ dung dÞch huyÒn phï ban ®Çu.
b) §èi víi mÉu d¹ng bét: C©n 10g mÉu cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g vµ cho vµo 90ml dÞch pha lo·ng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.2.2.2). Trén kü b»ng dông cô trén c¬ häc tõ 5 ®Õn 10 phót sao cho cã ®îc mét dung dÞch cã ph©n bè ®ång ®Òu, ®Ó l¾ng c¸c phÇn tö nÆng trong kho¶ng 15 phót, g¹n ®îc dung dÞch huyÒn phï ban ®Çu.
c) Dïng pipet ®· v« trïng hót 1ml dÞch huyÒn phï ban ®Çu (a hoÆc b) cho vµo 9 ml dÞch pha lo·ng, tr¸nh ch¹m pipet vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-10 gi©y, ®Ó cã dÞch pha lo·ng mÉu cã nång ®é lµ 10-2. LÆp l¹i c¸c thao t¸c nµy ®Ó thu ®îc dÞch pha lo·ng ®èi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang khö trïng lµ 10-5, 10-6, 10 -7 vµ ®èi víi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang kh«ng khö trïng lµ 10-3, 10-4 vµ 10-5.
3.2.4.1. 2. CÊy mÉu:
Dïng pipet v« trïng lÊy tõ dÞch mÉu pha lo·ng 10-5, 10-6, 10-7 ®èi víi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang khö trïng vµ 10-3, 10-4, 10-5 ®èi ph©n vi sinh vËt trªn nÒn chÊt mang kh«ng khö trïng mét lîng dÞch lµ 0,05 ml (1 giät) cÊy vµo 1 ®Üa petri chøa m«i trêng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.2.2.1). Mçi mÉu pha lo·ng ®îc cÊy lÆp l¹i trªn 3 ®Üa petri.
Dïng que g¹t v« trïng g¹t ®Òu dÞch mÉu trªn bÒ mÆt th¹ch, ®îi kh« vµ óp ngîc hép petri sau ®ã ®a vµo nu«i ë ®iÒu kiÖn kÞ khÝ (*) trong thêi gian vµ nhiÖt ®é thÝch hîp víi tõng lo¹i vi sinh vËt.
§Õm sè lîng khuÈn l¹c ®Æc trng cña mÉu gièng vi sinh vËt trªn mçi ®Üa petri.
MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra (ml) ®îc tÝnh theo c«ng thøc sau:
Trong ®ã:
A: MËt ®é vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ trªn ®¬n vÞ kiÓm tra (g hoÆc ml)
a: sè khuÈn l¹c trung b×nh cã trong ®Üa petri
d: nång ®é dÞch pha lo·ng
Ghi chó: Sè lîng khuÈn l¹c trung b×nh ®îc tÝnh lµ trung b×nh céng sè khuÈn l¹c cña c¸c ®Üa petri ®îc cÊy tõ cïng mét ®é pha lo·ng, trong ®ã chØ tÝnh c¸c ®Üa petri chøa tõ 5-50 khuÈn l¹c. Sè lîng khuÈn l¹c trung b×nh còng cã thÓ ®îc tÝnh lµ trung b×nh.
Céng sè lîng khuÈn l¹c cña c¸c ®Üa petri ®îc cÊy tõ hai ®é pha lo·ng kÕ tiÕp nhau b»ng c¸ch tÝnh sè khuÈn l¹c trung b×nh céng ë mçi ®é pha lo·ng, trong ®ã sè khuÈn l¹c ë ®é pha lo·ng cao h¬n ®îc nh©n víi 10, sau ®ã lÊy trung b×nh céng cña hai gi¸ trÞ trªn nÕu tû sè gi÷a gi¸ trÞ lín vµ gi¸ trÞ nhá kh«ng lín h¬n 2. NÕu tû sè nµy lín h¬n 2 th× lÊy gi¸ trÞ nhá lµm kÕt qu¶. MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra ®îc biÓu thÞ b»ng mét sè gi÷a 1,00 vµ 9,99 nh©n víi 10n, n lµ sè mò thÝch hîp.
(*): Cã thÓ sö dông mét trong c¸c ph¬ng ph¸p t¹o ®iÒu kiÖn kÞ khÝ sau:
- Lo¹i bá «xy b»ng ph¬ng ph¸p vËt lÝ:
+ Tñ nu«i kÞ khÝ hoÆc
+ B×nh hót Èm cã vßi hót ch©n kh«ng, hµn kÝn b»ng vad¬lin, kh«ng khÝ trong b×nh ®îc hót ra vµ thay b»ng hçn hîp khÝ CO2, N2, H2 (b×nh ch©n kh«ng). §Ó lo¹i bá «xy mét c¸ch triÖt ®Ó, tríc ®ã nªn ®Æt vµo trong b×nh c¸c cèc ®ùng chÊt hÊp thô «xy nh dithionit, clorua ®ång, iot... Cã thÓ lµm gi¶m t¸c dông cña «xy b»ng c¸ch thªm vµo m«i trêng dinh dìng c¸c chÊt khö «xy nh axit thioglycolic (0,3 ml/l) vµ systein (0,75 g/l).
- Lo¹i bá «xy trong kh«ng khÝ b»ng ph¬ng ph¸p ho¸ häc:
+ B×nh nu«i kÞ khÝ Gas Pak.
+ Sö dông dung dÞch xanh metylen-NaOH-glucoza: Trén ®Òu 3 dung dÞch víi 1 lîng b»ng nhau (6ml NaOH 10N trong 100ml níc cÊt; 3,0ml xanh metylen 5% trong 100ml níc cÊt vµ 6g glucoza trong 100ml níc cÊt cã bæ sung mét chót thymol kÕt tinh) råi cho vµo èng nghiÖm vµ ®un c¸ch thuû ®Õn mÊt mµu. §Æt èng chØ thÞ nµy vµo thiÕt bÞ nu«i cÊy kÝn. èng chØ thÞ sÏ t¹o ra t×nh tr¹ng yÕm khÝ trong thiÕt bÞ («xy ®îc khö hoµn toµn khi mµu xanh cña dung dÞch chØ thÞ bÞ biÕn mÊt vµ kh«ng t¸i hiÖn trë l¹i).
- Nu«i cÊy trong m«i trêng lµm ngËp kÐp: DÞch pha lo·ng mÉu ®îc trén víi m«i trêng th¹ch dinh dìng phï hîp víi tõng lo¹i vi sinh vËt sau khi khö trïng ®· ®Ó nguéi ®Õn 40 - 450C vµ ®æ vµo ®Üa petri. Sau khi th¹ch ®«ng ®æ thªm mét líp th¹ch - níc v« trïng (nguéi ®Õn 40 - 450C). ñ c¸c ®Üa th¹ch ë nhiÖt ®é thÝch hîp.
3.2.4.2. KiÓm tra mËt ®é vi sinh vËt kÞ khÝ ph©n gi¶i xenlulo:
3.2.4.2.1. Pha lo·ng mÉu:
Xem 3.2.4.1.1
3.2.4.2.2. CÊy mÉu:
Xem 3.2.4.1.2
- Ph¸t hiÖn vßng ph©n gi¶i: Sau khi khuÈn l¹c vi sinh vËt ®· ph¸t triÓn trªn ®Üa petri chøa m«i trêng kiÓm tra, ®Ó ®Üa petri vµo tñ l¹nh trong 12 giê. Sau ®ã cho vµo tñ Êm 400C trong 6 giê. LÊy ra, cho vµo mçi ®Üa petri 5ml thuèc thö lugon, tr¸ng ®Òu kh¾p mÆt th¹ch, ®Ó trong 15 phót råi g¹n bá hÕt thuèc thö lugon ®i. §Õm sè khuÈn l¹c trong ®Üa petri t¹o vßng ph©n gi¶i (vßng trong suèt) bao quanh khuÈn l¹c.
- TÝnh to¸n kÕt qu¶: xem 3.2.4.1.2
Phô lôc
I. M«i trêng kiÓm tra vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ kÞ khÝ:
1. M«i trêng 1:
Níc cÊt 1000ml
Glucoza 20,0g
K2HPO4 1,0g
MgSO4.7H2O 0,5g
NaCl vÕt
FeSO4.7H2O vÕt
MnSO4.5H2O vÕt
CaCO3 40,0g
axit ascobic 1,0g
E.D.T.A. (Trilon B) 1,0g
Th¹ch bét 15,0g
2. M«i trêng2:
Níc chiÕt khoai t©y(*) 1000ml
Glucoza 20,0g
K2HPO4 0,2g
MgSO4.7H2O 0,2g
Axit ascobic 1,0g
CaCO3 3,0g
Th¹ch bét 15,0g
(*) Níc chiÕt khoai t©y: Khoai t©y: 200,0g
Níc cÊt: 500ml
Khoai t©y gät vá, c¾t nhá, ®un s«i trong 15 phót, läc trong, bæ sung ®ñ
1000ml
II. M«i trêng kiÓm tra vi sinh vËt ph©n gi¶i xenlulo kÞ khÝ:
1. M«i trêng3:
Níc m¸y 1000ml
NaNH4HPO4 1,5g
KH2PO4 0,5g
NaCl 0,1g
K2HPO4 0,5g
MgSO4.7H2O 0,4g
Pepton 5,0g
CaCO3 2,0g
Dung dÞch MnSO4.5H2O 1% 1 giät
Dung dÞch FeSO4.7H2O 1% 1 giät
CMC 20,0g
Th¹ch bét 15,0g
pH: 7,0-7,4
2. M«i trêng 4:
Níc m¸y 500ml
Níc thÞt-pepton 500ml
CaCO3 2,0g
CMC 15,0g
Th¹ch bét 15,0g
pH: 7,0-7,4
3. M«i trêng 5:
Níc m¸y 900ml
Níc chiÕt nÊm men 100ml
Glucoza 0,5g
Pepton 5,0g
CMC 3,0g
Th¹ch bét 15,0g
pH: 7,4
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |