2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và cấy chuyển nguyên bào sợi chuột Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau:
-
Nguyên bào sợi phân lập từ thai chuột được nuôi trong chai nuôi cấy T25 có môi trường nuôi cấy thích hợp với nguyên bào sợi. Mật độ tế bào ban đầu khoảng 4x103 tế bào/cm2. Chai nuôi được để trong vào tủ ấm 370 C, độ ẩm 95% và 5% CO2.
-
Các tế bào tăng sinh và đạt mật độ trên 90% bề mặt chai cần phải được cấy chuyển sang chai mới. Các bước được tiến hành như sau:
-
Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS.
-
Đưa 0,5 ml dung dịch trypsin/EDTA vào chai nuôi cấy và để ở 370C.
-
Khi tế bào tách hoàn toàn khỏi bề mặt chai, bất hoạt trypsin bằng 2,5 ml môi trường nuôi cấy có FBS.
-
Thu dung dịch có chứa tế bào và chia đề vào 3 chai nuôi cấy mới. Thêm 2ml môi trường vào mỗi chai.
-
Nuôi cấy ở 370C và 5% CO2 và thay môi trường sau 24 giờ.
2.2.2. Phương pháp thu môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B:
Nguyên bào sợi được phân lập từ thai chuột và nuôi cấy in vitro. Sau khi chuyển nhiễm vector pT2/BH–CVpf–SB11 mang gen cecropin B, nguyên bào sợi này sẽ được nuôi trong chai nuôi cấy tế bào T25 với môi trường nuôi nguyên bào sợi. Sau 5 ngày, 13 ngày và 21 ngày sẽ tiến hành thu môi trường nuôi cấy để kiểm tra hoạt tính của cecropin có trong môi trường.
-
Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành thay môi trường lần 1. Dùng pipetman hút 2,5 ml môi trường từ chai nuôi cấy ra. Bổ sung 2,5 ml môi trường mới vào chai nuôi cấy. Môi trường cũ vừa được hút ra từ chai nuôi cấy được thu vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, quấn paraffin rồi cất giữ ở 2 – 8oC. Môi trường thu nhận làn này ký hiệu là môi trường nuôi cấy F1.
-
Sau 13 ngày, tiến hành thay môi trường lần 2. Phương pháp làm tương tự như thay môi trường lần 1. Môi trường thu nhận lần này ký hiệu là môi trường nuôi cấy F2.
-
Sau 21 ngày, tiến hành thay môi trường lần 3. Môi trường thu nhận làn này ký hiệu là môi trường nuôi cấy F3.
2.2.3. Phương pháp cô đặc môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B -
Ống eppendorf chứa 1ml môi trường được chuyển vào bình kín vô trùng và nối với máy hút chân không qua ống nhựa chịu áp lực.
-
Toàn bộ bình được đặt trong hộp chứa nước đá để giữ lạnh môi trường.
-
Bật máy hút để làm khô toàn bộ nước trong ống eppendorf.
-
Thêm 100µl nước cất vô trùng vào mỗi ống.
Dung dịch thu được có độ đậm đặc gấp 10 lần so với môi trường nuôi cấy mới thu và được dùng cho các thử nghiệm trên vi khuẩn.
2.2.4. Phương pháp nhân nuôi và cất giữ vi khuẩn
- Chuẩn bị:
-
Môi trường LB lỏng
-
Ồng penicilline vô trùng
-
Các chủng VSV
Các chủng VSV dùng để thử nghiệm gồm có: Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Klebsiella. sp, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis
- Tiến hành thí nghiệm:
-
Khử trùng box thí nghiệm
-
Dùng pipetman hút môi trường LB lỏng vào các ống penicilline, 5ml LB/ống.
-
Dùng que cấy vi khuẩn để lấy vi khuẩn kiểm định từ ống giống.
-
Cho que cấy đã lấy vi khuẩn từ ống giống vào trong môi trường LB, khuấy đều đến khi vi khuẩn vừ que cấy tan hết vào môi trường.
-
Đậy nút bông và quấn giấy bạc cho ống nuôi vi khuẩn.
-
Nuôi vi khuẩn ở máy lắc, 150 vòng/phút trong vòng 14 – 24h.
-
Kiểm tra sự sinh trưởng và mật độ vi khuẩn. Khi vi khuẩn đạt tới mức sinh trưởng tối ưu, cất ống nuôi vi khuẩn vào tủ mát, ở nhiệt độ 2 – 80C.
2.2.5. Phương pháp đục lỗ
- Chuẩn bị:
-
Các chủng VSV thử nghiệm
-
Môi trường thạch thường
-
Đĩa peptri khử trùng
-
Cồn, nước cất, đầu côn khử trùng, các dụng cụ để trans vi khuẩn, đục lỗ
- Tiến hành thí nghiệm:
-
Khử trùng box thí nghiệm
-
Đun nóng chai môi trường thạch thường đã được chuẩn bị sẵn. Đun đến khi môi trường thạch tan chảy hoàn toàn. Để khoảng 30 phút – 1h cho môi trường nguội bớt (nhưng chưa bị đông trở lại).
-
Đổ môi trường thạch ra đĩa peptri. Độ dày của môi trường khoảng 1/2 đến 2/3 chiều cao đĩa.
-
Đậy hờ nắp đĩa peptri. Bật UV box cấy và để khoảng 30 phút cho môi trường thạch ở đĩa nguội hẳn và đông lại.
-
Lấy các chủng VSV cần thử nghiệm cấy vào đĩa peptri: lắc đều chai dịch nuôi VSV rồi hút khoảng 5 – 10 µl dịch VSV nhỏ vào đĩa peptri. Trans đều dịch VSV ra khắp bề mặt đĩa nuôi cấy.
-
Đục lỗ để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: sử dụng dụng cụ đục lỗ, khử trùng bằng cồn và đốt nóng trên ngọn lửa đèn cồn. Để khoảng 2 phút cho thanh đục lỗ nguội hẳn, ấn mạnh để tạo thành vòng trong đĩa thạch nuôi vi khuẩn. Sau đó dùng que vô trùng để lấy miếng thạch ở vòng vừa đục cho ra ngoài. Ta được lỗ đục dùng để thí nghiệm.
-
Tùy thiết kế từng thí nghiệm mà ta đục số lỗ / 1 đĩa cho phù hợp. Luôn luôn có một lỗ dùng làm đối chứng.
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau:
2.2.6.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng sinh
- Chuẩn bị:
-
Chất kháng sinh: ampicillin và puromycin với các nồng độ 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml
-
Các chủng VSV cần thử nghiệm: Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Klebsiella. sp, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis.
Các chủng VSV này đã được nuôi trên đĩa thạch, với môi trường thạch thường, và đã được đục lỗ.
- Tiến hành thí nghiệm:
-
Cho 100 µl mỗi nồng độ của mỗi loại kháng sinh vào mỗi lỗ đục (cụ thể tùy từng thiết kế thí nghiệm). Lỗ đối chứng không cho kháng sinh vào.
-
Gói các đĩa peptri cẩn thận bằng giấy báo và đem cất giữ ở 2- 80 C trong khoảng 5 – 6h. Sau đó chuyển các đĩa nuôi cấy sang tủ 370 C để VSV sinh trưởng.
-
Sau khoảng 14h kiểm tra kết quả về sự sinh trưởng của VSV và sự tạo thành vòng kháng khuẩn ở các lỗ.
2.2.6.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptide cecropin B:
- Chuẩn bị:
-
Peptide cecropin B: với các nồng độ 20 µM/ml, 30 µM/ml, 40 µM/ml
-
Các chủng VSV cần thử nghiệm: Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Klebsiella. sp, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis.
Các chủng VSV này đã được nuôi trên đĩa thạch, với môi trường thạch thường, và đã được đục lỗ.
- Tiến hành thí nghiệm:
-
Mỗi nồng độ mỗi của peptide cecropin B cho 100 µl vào mỗi lỗ đục (cụ thể tùy từng thiết kế thí nghiệm). Lỗ đối chứng không cho cecropin vào.
-
Gói các đĩa peptri cẩn thận bằng giấy báo, đem cất giữ ở 2- 80 C trong khoảng 5 – 6h. Sau đó chuyển các đĩa nuôi cấy sang tủ 370 C để VSV sinh trưởng.
-
Sau khoảng 14h kiểm tra kết quả về sự sinh trưởng của VSV và sự tạo thành vòng kháng khuẩn ở các lỗ.
2.2.6.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của CKS kết hợp với peptide cecropin B:
- Chuẩn bị:
-
Chất kháng sinh: ampicillin và puromycin với các nồng độ 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml
-
Peptide cecropin B: với các nồng độ 20 µM/ml, 30 µM/ml, 40 µM/ml
-
Các chủng VSV cần thử nghiệm: Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Klebsiella. sp, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis.
Các chủng VSV này đã được nuôi trên đĩa thạch, với môi trường thạch thường, và đã được đục lỗ.
- Tiến hành thí nghiệm:
-
Mỗi lỗ đục cho 100 µl dung dịch thử nghiệm. Thử nghiệm kết hợp kháng sinh và cecropin B ta cho 50 µl kháng sinh và 50 µl cecropin B vào mỗi lỗ. Lỗ đối chứng không cho dung dịch thử nghiệm vào.
-
Gói các đĩa peptri cẩn thận bằng giấy báo, đem cất giữ ở 2- 80 C trong khoảng 5 – 6h. Sau đó chuyển các đĩa nuôi cấy sang tủ 370 C để VSV sinh trưởng.
-
Sau khoảng 14h kiểm tra kết quả về sự sinh trưởng của VSV và sự tạo thành vòng kháng khuẩn ở các lỗ.
2.2.6.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B:
- Chuẩn bị:
-
Môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B: Môi trường nuôi cấy này không bổ sung kháng sinh, thu nhận sau một số ngày nuôi nguyên bào sợi chuyển gen.
Môi trường thử nghiệm gồm có môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuyển gen F1 (được thu 5 ngày sau khi nuôi nguyên bào sợi chuyển gen), F2 (được thu 13 ngày sau khi nuôi nguyên bào sợi chuyển gen), và F3 (được thu 21 ngày sau khi nuôi nguyên bào sợi chuyển gen).
-
Các chủng VSV cần thử nghiệm: Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis.
Các chủng VSV này đã được nuôi trên đĩa thạch, với môi trường thạch thường, và đã được đục lỗ.
- Tiến hành thí nghiệm:
-
Mỗi lỗ đục cho 100 µl môi trường nuôi cấy tế bào. Lỗ đối chứng không cho môi trường.
-
Gói các đĩa peptri cẩn thận bằng giấy báo, đem cất giữ ở 2- 80 C trong khoảng 5 – 6h. Sau đó chuyển các đĩa nuôi cấy sang tủ 370 C để VSV sinh trưởng.
-
Sau khoảng 14h kiểm tra kết quả về sự sinh trưởng của VSV và sự tạo thành vòng kháng khuẩn ở các lỗ.
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |
