TS. NguyÔn Lai Thµnh



tải về 329.51 Kb.
trang9/9
Chuyển đổi dữ liệu07.07.2016
Kích329.51 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT NHẮT TRẮNG CHUYỂN GEN CECROPIN B


Hiện nay, với tiềm năng của các peptide kháng khuẩn, nhiều nhà khoa học đã tìm cách tạo các sinh vật có khả năng tạo các peptide kháng khuẩn tái tổ hợp với mục đích đưa vào ứng dụng trong thực tế đời sống. Tuy nhiên, những peptide tái tổ hợp này đều cần phải kiểm tra hoạt tính.

Tại một số phòng thí nghiệm của khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã thành công trong việc đưa gen cecropin B vào vi khuẩn và tế bào động vật. Việc kiểm tra hoạt tính của loại cecropin này đã và đang được thực hiện. Trong giới hạn đề tài này, chúng tôi đã thử nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của những tế bào chuột nuôi cấy đã được chuyển gen cecropin B có khả năng biểu hiện và xuất tiết ra môi trường. Quần thể tế bào sau chuyển gen đã được xác định có mang gen chuyển bằng kỹ thuật PCR và tạo được sản phẩm có hoạt động chức năng thông qua gen báo cáo GFP khi kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Những quẩn thể tế bào được nuôi cấy trong môi trường không có kháng sinh và môi trường được thu ở ngày thứ 5, 13 và 21 sau khi chuyển gen được ký hiệu tương ứng là F1, F2 và F3. Môi trường được cô đặc 10 lần để tăng nồng độ cecropin.

Chúng tôi đã thử nghiệm với ba chủng vi khuẩn để thử nghiệm hoạt kháng khuẩn trong đó là chủng Bacillus subtilis không kháng kháng sinh và hai chủng Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis có kháng kháng sinh đều có độ nhạy cảm tốt với cecropin

Với môi trường ký hiệu F1, ở cả ba chủng vi khuẩn thử nghiệm đều cho vòng kháng khuẩn, với cả ba lần thí nghiệm lặp lại. Tuy nhiên vòng kháng khuẩn ở cả ba chủng vi khuẩn đều có đường kính tương đối nhỏ (khoảng 9 – 10 mm).

Với môi trường ký hiệu F2 và F3, các lần thử nghiệm đều không cho vòng kháng khuẩn ở cả ba chủng vi khuẩn (Hình 12).



Hình 12. Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn của môi trường đã nuôi cấy nguyên bào sợi thai chuột sau chuyển gen



(1): Môi trường F1, (2): Môi trường F2, (3): Môi trường F3, (4): Đối chứng

Kết quả trên đã chứng minh rằng gen cecropin B không những đã hội nhập được vào hệ gen của nguyên bào sợi chuột nuôi cấy mà còn được biểu hiện thành peptide kháng khuẩn cecropin.



Qua quá trình thí nghiệm, số lượng mẫu cho biểu hiện gen còn khá hạn chế. Điều này có thể do khả năng hoạt động của vector trong việc chèn gen vào hệ gen chưa cao hoặc hoạt động đó ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi cá. Ngoài ra, khả năng kháng khuẩn thấp còn có thể do lượng cecporin được tiết ra hạn chế, do đó nồng độ peptide này trong môi trường ở mức rất thấp.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN


Từ quá trình nghiên cứu với các kết quả trên chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

  1. Trong bảy chủng vi khuẩn gây bệnh đã xác định được có 2 chủng kháng với kháng sinh ampicillin và puromycin là Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis.

  2. Nồng độ kháng khuẩn tối thiểu (MIC) của cecropin đối với E.coli là 30 µM/ml và 6 chủng còn lại là 40 µM/ml.

  3. Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh ampicilin và puromicin và tạo sự nhạy cảm ở chủng kháng thuốc.

  4. Đã phát hiện khả năng kháng khuẩn ở mức thấp của môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột đã chuyển gen cecropin B.

KIẾN NGHỊ


Với những kết quả thu được chúng tôi xin đưa ra một số hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:

  1. Tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt là các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh.

  2. Tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khả năng kháng khuẩn của môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của môi trường này với các chủng vi khuẩn gây bệnh khác. Đồng thời thử nghiệm nhiều môi trường nuôi cấy của nhiều thế hệ nguyên bào sợi chuyển gen để đánh giá sự biểu hiện thành peptide kháng khuẩn của gen cecropin B được chuyển vào tế bào.


TÀI LIỆU THAM KHẢO


Tiếng việt

  1. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh học công nghiệp, Nxb khoa học và kỹ thuật Hà Nội

  2. Nguyễn Thị Bích Đào (2011), Thử nghiệm phương pháp chuyển gen qua tinh trùng để chuyển gen Cecropin vào cá ngựa vằn, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

  3. Lý Thị Thanh Hà (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn hiếm phân lập tại Trùng Khánh – Cao Bằng, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

  4. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học.

  5. Nguyễn Mộng Hùng, Quyền Đình Thi, Đỗ Lê Thăng, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Nguyễn Chí Thành (2007), Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý và ứng dụng của DNA tái tổ hợp (Dịch từ nguyên bản tiếng Anh- Molecular Biotechnology Principles and applications of recombinant DNA), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

  6. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2007), Công nghệ sinh học trên người và động vật, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh.

  7. Hoàng Thị Thanh Phương (2011), Thử nghiệm phương pháp vi tiêm để chuyển gen Cecropin vào hợp tử cá ngựa vằn, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

  8. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2006), Công nghệ sinh học, Tập 2, NXB Giáo dục, Hà Nội.

Tiếng Anh

9. Andersson, E., V. Rydengard, A. Sonesson, M. Morgelin, L. Bjorck, and A. Schmidtchen, (2004), "Antimicrobial activities of heparin-binding peptides". European journal of biochemistry / FEBS. 271(6): p. 1219-26.

10. Andra, J., O. Berninghausen, and M. Leippe, (2001), "Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans". Medical Microbiology Immunology. 189(3): p. 169-173.

11. Andreu, D., R.B. Merrifield, H. Steiner, and H.G. Boman, (1983), "Solid-phase synthesis of cecropin A and related peptides". Proceedings of the National Academy of Sciences. 80(21): p. 6475-6479.

12. Beisswenger, C. and R. Bals, (2005), "Antimicrobial Peptides in Lung Inflammation". Chem Immunol Allergy. 86: p. 55-71.

13. Benincasa, M., M. Mattiuzzo, Y. Herasimenka, P. Cescutti, R. Rizzo, and R. Gennaro, (2009), "Activity of antimicrobial peptides in the presence of polysaccharides produced by pulmonary pathogens". Journal of Peptide Science. 15(9): p. 595-600.

14. Bowdish, D.M.E., D.J. Davidson, and R.E.W. Hancock, (2005), "A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity". Current Protein & Peptide Science. 6(1): p. 35-51.

15. Brumfitt, W., M.R.J. Salton, and J.M.T. Hamilton-Miller, (2002), "Nisin, alone and combined with peptidoglycan-modulating antibiotics: activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci". Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 50(5): p. 731-734.

16. Bulet, P., R. Stöcklin, and L. Menin, (2004), "Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates". Immunological Reviews. 198(1): p. 169-184.

17. Christopher, W., Antibiotic: Action, origin, resistance, American Society for microbiology. 2003, Washington, D.C.

18. Giuliani, A., G. Pirri, and S.F. Nicoletto, (2007), "Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics". Central European Journal of Biology. 2(1): p. 1-33.

19. Gordon, J.W. and F.H. Ruddle, (1981), "Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei". Science. 214(4526): p. 1244-1246.

20. Gossler, A., R.K. T Doetschman, and R.K. E Serfling, (1986), "Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83(23): p. 9065-9069.

21. Hancock, R.E.W. and H.-G. Sahl, (2006), "Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies". Nat Biotech. 24(12): p. 1551-1557.

22. Henrik Suttmann, C.A., M. Retz, F. Paulsen, J. Harder, U. Zwergel, J. Kamradt, B. Wullich, G. Unteregger, M. Stöckle, and J. Lehmann, (2008), "Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells". BioMed Central Ltd.

23. Hertzog, P.J., Isolation of Embryonic Fibroblasts and Their Use in the In vitro Characterization of Gene Function, in Gene Knockout Protocols. 2001. 205-215.

24. Imler, J.-L. and P. Bulet, (2005), "Antimicrobial peptides in Drosophila: structures, activities and gene regulation". Chemical Immunology and Allergy. 86(1): p. 1-21.

25. Izadpanah, A. and R.L. Gallo, (2005), "Antimicrobial peptides". Journal of the American Academy of Dermatology. 52(3): p. 381-390.

26. Jenssen, H., P. Hamill, and R.E.W. Hancock, (2006), "Peptide Antimicrobial Agents". Clin Microbiol Rev. 19(3): p. 491–511.

27. Kirschstein, R. and L.R. Skirboll, Stem cells: Scientific progress and future research directions. 2001, US Department of Health and Human Services: The National Institutes of Health.

28. Kong, B.W., D.F. Carlson, S.C. Fahrenkrug, and D.N. Foster, (2008), "Application of the Sleeping Beauty transposon system to avian cells". Animal Genetic. 39(2): p. 180–186.

29. Kragol, G., S. Lovas, G. Varadi, B.A. Condie, R. Hoffmann, and L. Otvos, (2001), "The Antibacterial Peptide Pyrrhocoricin Inhibits the ATPase Actions of DnaK and Prevents Chaperone-Assisted Protein Folding†". Biochemistry. 40(10): p. 3016-3026.

30. Kroppenstedt, R.M., S. Mayilraj, J.M. Wink, W. Kallow, P. Schumann, C. Secondini, and E. Stackebrandt, (2005), "Eight new species of the genus Micromonospora, Micromonospora citrea sp. nov., Micromonospora echinaurantiaca sp. nov., Micromonospora echinofusca sp. nov. Micromonospora fulviviridis sp. nov., Micromonospora inyonensis sp. nov., Micromonospora peucetia sp. nov., Micromonospora sagamiensis sp. nov., and Micromonospora viridifaciens sp. nov". Systematic and Applied Microbiology. 28(4): p. 328-339.

31. Kruszewska, D., H.-G. Sahl, G. Bierbaum, U. Pag, S.O. Hynes, and Ã.S. Ljungh, (2004), "Mersacidin eradicates methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a mouse rhinitis model". Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 54(3): p. 648-653.

32. Kulagina, N.V., K.M. Shaffer, F.S. Ligler, and C.R. Taitt, (2007), "Antimicrobial peptides as new recognition molecules for screening challenging species". Sensors and Actuators B: Chemical. 121(1): p. 150-157.

33. Lavitrano, M., (2006), "Sperm-mediated gene transfer". Fertility and Development. 18: p. 19-23.

34. Levy, S.B., (1998), "The challenge of antibiotic resistance". Sci. Am. 278: p. 46-53.

35. Luo, G., Z. Ivics, Z. Izsvak, and A. Bradley, (1998), "Chromosomal transposition of a Tc1/mariner-like element in mouse embryonic stem cells". Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18): p. 10769-73.

36. Masuda, M., H. Nakashima, T. Ueda, H. Naba, R. Ikoma, A. Otaka, Y. Terakawa, H. Tamamura, T. Ibuka, T. Murakami, Y. Koyanagi, M. Waki, A. Matsumoto, N. Yamamoto, S. Funakoshi, and N. Fujii, (1992), "A novel anti-HIV synthetic peptide, T-22 ([Tyr5,12,Lys7]-polyphemusin II)". Biochemical and Biophysical Research Communications. 189(2): p. 845-850.

37. Mattick, A. and A. Hirsch, (1947), "Further observations on an inhibitory substance (nisin) from lactic streptococci". Lancet ii. 2(6462): p. 5-8.

38. Moore, A., D. Devine, and M. Bibby, (1994), "Preliminary experimental anticancer activity of cecropins". Pept Res. 7(5): p. 265-269.

39. Moore, A.J., W.D. Beazley, M.C. Bibby, and D.A. Devine, (1996), "Antimicrobial activity of cecropins". Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 37: p. 1077-1089.

40. Mourgues, F., M.-N.L. Brisset, and E. Chevreau, (1998), "Activity of different antibacterial peptides on Erwinia amylovora growth, and evaluation of the phytotoxicity and stability of cecropins". Plant Science. 139: p. 83-91.

41. Omura and Satoshi, The Search for Bioactive Compounds from Microorganisms, ed. p.b.S. Verlag. 1992, New York.

42. Otvos, L., I. O, M.E. Rogers, P.J. Consolvo, B.A. Condie, S. Lovas, P. Bulet, and M. Blaszczyk-Thurin, (2000), "Interaction between Heat Shock Proteins and Antimicrobial Peptides†". Biochemistry. 39(46): p. 14150-14159.

43. Pouny, Y., D. Rapaport, A. Mor, P. Nicolas, and Y. Shai, (1992), "Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes". Biochemistry. 31(49): p. 12416-12423.

44. Qu, Y., T.S. Istivan, A.J. Daley, D.A. Rouch, and M.A. Deighton, (2009), "Comparison of various antimicrobial agents as catheter lock solutions: preference for ethanol in eradication of coagulase-negative staphylococcal biofilms". Journal of Medical Microbiology. 58(4): p. 442-450.

45. Robert, W.B., International Edition Microbiology. 2004, San Francisco: Person Benjanmin.

46. Sallum, U.W. and T.T. Chen, (2008), "Inducible Resistance of Fish Bacterial Pathogens to the Antimicrobial Peptide Cecropin B". ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY: p. 3006–3012.

47. Sidén, I. and H.G. Boman, (1983), "Escherichia coli mutants with an altered sensitivity to cecropin D". J Bacteriol. 154(1): p. 170–176.

48. Silvestro, L., K. Gupta, J.N. Weiser, and P.H. Axelsen, (1997), "The concentration-dependent membrane activity of cecropin A". Biochemistry. 36(38): p. 11452-60.

49. Silvestro, L.S., (2000), "Function and structure of cecropin A". ProQuest.

50. Staneck, J.L. and G.D. Robert, (1974), "Simplified approach to identification of coryneform bacteria with LL-diaminopimelic acid in the cell wall". J. Gen. Microbiol. 29: p. 59 – 71.

51. Stutzman – Engwall, K.J., S.L. Otten, and C.R. Hutchison, (1992), "Regulation of secondary metabolism in Streptomyces spp. and overproduction of daunorubicin in Streptomyces peucetius". Biological control. 174(1): p. 144 – 145.

52. Subbalakshmi, C. and N. Sitaram, (1998), "Mechanism of antimicrobial action of indolicidin". FEMS Microbiol. Lett. 160: p. 91–96.

53. Szabo, E., R.M.R. S. Rampalli, R.M. A. Schnerch, A. Fiebig-Comyn, M. Levadoux-Martin, and M. Bhatia, (2001), "Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors". Nature. 468(7323): p. 521-526.

54. Tennessen, J.A., (2005), "Molecular evolution of animal antimicrobial peptides: widespread moderate positive selection". Journal of Evolutionary Biology. 18(6): p. 1387-1394.

55. Tong Chai, K., L. Phuripun, and C. Chẩn, Antibiotic Production of actinomycetes in Forest Termite Soil. 1995. 20 – 40.

56. Vaara, M. and T. Vaara, (1994), "Ability of cecropin B to penetrate the enterobacterial outer membrane". Antimicrob Agents Chemother. 38(10): p. 2498–2501.

57. Weissman-Shomer, P. and M. Fry, (1975), "Chick embryo fibroblasts senescence in vitro: Pattern of cell division and life span as a function of cell density". Mechanisms of Ageing and Development. 4: p. 159-166.

58. Yeaman, M.R. and N.Y. Yount, (2003), "Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance". Pharmacological Reviews. 55(1): p. 27-55.

59. Zasloff, M., (2002), "Antimicrobial peptides of multicellular organisms". Nature. 415(6870): p. 389-395.


 Trang web tham khảo


  1. http://people.ucalgary.ca/~browder/transgenic.html

  2. http://www.stada.com.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=418:khang-khang-sinh-cn-bnh-khong-co-thuc-cha-trong-tng-lai&catid=59:thuc-va-sc-khe&Itemid=193





Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học
1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2016
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương