TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN

Kết quả kiểm tra DNA tổng số

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số

Bước đầu tiên của kỹ thuật MLPA cũng như hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử khác là tách chiết DNA, đây là công đoạn rất quan trọng. Để các phản ứng tiếp theo được tối ưu và chính xác, mẫu DNA cần đảm bảo đủ nồng độ, độ tinh sạch, không bị đứt gãy trong qua trình tách chiết. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp Phenol/ Chloroform để tách chiết DNA của các bệnh nhân TSTTBS và các thành viên trong gia đình tham gia vào nghiên cứu. Sau khi tách chiết, DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng 2 phương pháp đo mật độ quang trên máy Nano Drop ở bước sóng 260 nm và 280 nm và điện di DNA tổng số. Kết quả đo mật độ quang cho thấy các mẫu DNA thu được có nồng độ và độ tinh sạch khá cao. Bên cạnh kết quả đo mật độ quang, kết quả điện di DNA tổng số cho thấy hình ảnh các băng DNA khá rõ nét, không có băng phụ và các vết mờ, chứng tỏ DNA đảm bảo độ tinh sạch, không bị đứt gãy và đủ nồng độ để thực hiện các phản ứng tiếp theo [12],[13].

3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh

Bảng 3.1. Các thành viên trong gia đình bệnh nhân

Tiến hành xác định đột biến gen trên nhóm bệnh nhân bằng kỹ thuật MLPA, kết quả cho thấy: Đã phát hiện được 6/10 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn exon. Tiến hành xác định người lành mang gen bệnh trên nhóm bố, mẹ và một số thành viên gia đình đã phát hiện được tình trạng mang gen ở trạng thái dị hợp tử (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Kiểu đột biến gen của bệnh nhân và thành viên gia đình

STT	Bệnh nhân (alen/alen)	Bố (alen)	Mẹ (alen)	Em trai (alen)	Em gái (alen)
1	Ex1 – Ex8 del/ Ex1 – Ex8 del	Ex1 – Ex8 del	Ex1 – Ex8 del
2	Ex1 – Ex3 del/ Ex1 – Ex3 del	Ex1 – Ex3 del	Ex1 – Ex3 del
3	Ex1 – Ex8 del/ (-)	(-)	Ex1 – Ex8 del
4	Ex1 – Ex3 del/ (-)	(-)	Ex1 – Ex3 del
5	Ex1 – Ex3 del/ I172N	Ex1 – Ex3 del	I172N	(-)	Ex1 – Ex3 del/ I172N
6	Ex1 – Ex3 del/ (-)	Ex1 – Ex3 del	(-)

(-) : Không phát hiện thấy đột biến xóa đoạn;

Del: Xóa đoạn

Ở nhóm bệnh nhân có đột biến, phát hiện 2/6 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 hoặc exon 1- 8 và 1 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn kết hợp với đột biến I172N dị hợp tử. Các bệnh nhân còn lại mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 hoặc dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 8.

Ở nhóm bố mẹ và các thành viên gia đình bệnh nhân (em trai, em gái) đã phát hiện thấy đột biến xóa đoạn, phát hiện 4/6 người bố mang gen và 5/6 người mẹ mang gen, 1 em gái của bệnh nhân MS05 có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 kết hợp với đột biến dị hợp tử I172N.

Đột biến xóa đoạn trên gen CYP21A2 trong nghiên cứu của chúng tôi phát hiện được 6/10 trường hợp, trong đó hay gặp đột biến tại vị trí exon 1 và exon 3. Có 2 trường hợp mang đột biến đồng hợp tử, còn lại là các trường hợp đột biến dị hợp tử, có 1 trường hợp mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 kết hợp với đột biến I172N. Tỷ lệ mang đột biến xóa đoạn trên thế giới khoảng 20% trong các alen [1], [11]. Nghiên cứu ở các nước cho thấy kết quả tương tự như tại Đức (30,3%), tại Mỹ (26%) và tại Hồng Kông (27%). Trên thế giới phân tích 3554 allen cho thấy tỷ lệ gặp đột biến xóa đoạn là 24,4% [15],[20],[22].

Một nghiên cứu ở Ý, Paola. C, năm 2009, tác giả phân tích gen cho 18 bệnh nhân TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH bằng kỹ thuật MLPA nhận thấy tỷ lệ bệnh nhân có mang đột biến xóa đoạn là 7/18 (38,9%). Trong đó có 4 bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn và đột biến điểm như p.V281L (2 trường hợp), p. P453S (1 trường hợp) và p.P482S (1 trường hợp) [34].

Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trong 6 gia đình bệnh nhân TSTTBS phát hiện đột biến bằng kỹ thuật MLPA, 2 bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử xoá đoạn exon 1- 3 và exon 1- 8 thì cả bố và mẹ là người mang gen. 3 bệnh nhân dị hợp tử xoá đoạn khác thì có 1 trường hợp bố là người mang gen, 2 trường hợp mẹ là người mang gen. 1 trường hợp đột biến dị hợp tử phối hợp thì bố là người mang gen xoá đoạn exon 1- 3 còn mẹ là người mang gen đột biến I172N; bệnh nhân này có 1 em trai và 1 em gái, trong đó em trai là người bình thường còn em gái cũng là người mang đột biến dị hợp tử phối hợp giống bệnh nhân. Kết quả xác định đột biến gen trên các thành viên gia đình bệnh nhân cũng phù hợp với quy luật di truyền đơn gen lặn. Tần suất bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là 1/10.000-1/16.000 trẻ sơ sinh, trong khi đó tỷ lệ người mang gen bệnh là 1/55, khi hai dị hợp tử kết hôn với nhau thì khả năng sinh con bị bệnh 25%. Gen bệnh được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nếu kết hôn họ hàng, hoặc ở quần thể cô lập sẽ tăng tỷ lệ mắc bệnh vì các gen gây bệnh dễ dàng có cơ hội tổ hợp lại với nhau để sinh ra trẻ bị bệnh [28], [35],[37].

Theo các nghiên cứu trên thế giới tỷ suất mang gen bệnh TSTTBS dị hợp tử là 11,2 - 12,6 %/1.000 hay tỷ lệ 1/ 83 đối với quần thể người Trung Quốc. Trong khi các báo cáo khác trên thế giới thì tỷ lệ chung người mang gen dị hợp tử là 1/60 [35],[37]. Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đưa ra tỷ lệ người lành mang gen bệnh.

Hình 3.3. Phả hệ gia đình số 01

Người bình thường

Hình 3.4. Kết quả MLPA gia đình mã số 01

Hình ảnh phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA trên gen CYP21A2 cho thấy ở người bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân không thấy xuất hiện các đỉnh tương ứng với exon 1 đến exon, vì vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ exon 1 đến exon 8. Phân tích kết quả ở người bố và người mẹ bệnh nhân cho thấy các đỉnh của exon 1 đến exon 8 chỉ bằng 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố, mẹ bệnh nhân là người mang gen bệnh.

Kết quả phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia đình MS02:

Hình 3.5. Phả hệ gia đình số 02

Gia đình có con gái 2 tuổi bị bệnh TSTTBS thể mất muối, kiểu gen đột biến là đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Bố mẹ bệnh nhân có kiểu hình bình thường và đều mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Trong gia đình không ai mắc bệnh giống bệnh nhân.

Kiểu gen của gia đình số 02

Hình 3.6. Kết quả MLPA của gia đình mã số 02

Hình 3.7. Phả hệ gia đình số 03

Phả hệ có 3 thế hệ, thế hệ thứ 1 và thứ 2 không có ai bị bệnh. Ở thế hệ thứ 3 có 1 gia đình có con trai 3 tuổi bị bệnh TSTTBS (III.4 ) thể mất muối và kiểu gen đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 8. Bố và mẹ có kiểu hình bình thường, mẹ mang gen dị hợp tử đột biến xóa đoạn exon 1 đến exon 8.

Kiểu gen của gia đình số 03

Hình 3.8. Kết quả MLPA của gia đình mã số 03

Hình ảnh phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA (hình 3.8) trên gen CYP21A2 cho thấy ở người bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân các đỉnh từ exon 1 đến exon 8 chỉ bằng 1/2 người bình thường, vì vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon 1 đến exon 8. Phân tích kết quả ở người bố thấy tất cả các đỉnh của gen CYP21A2 đều bình thường chứng tỏ bố không có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 còn người mẹ bệnh nhân cho thấy các đỉnh của exon 1 đến exon 8 chỉ bằng 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ mẹ bệnh nhân là người mang gen bệnh.

Kết quả phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia đình MS04:

Hình 3.9. Phả hệ gia đình số 04

Gia đình có con gái 3 tháng bị bệnh TSTTBS thể mất muối nặng với kiểu gen đột biến dị hợp xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Phân tích phả hệ, gia đình không có ai bị bệnh giống bệnh nhân, bố 23 tuổi, mẹ 21 tuổi là người bình thường về lâm sàng, mẹ mang gen dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3.

Kiểu gen của gia đình số 04

Hình 3.10. Kết quả MLPA của gia đình mã số 04

Hình ảnh phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA trên gen CYP21A2 cho thấy ở người bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân các đỉnh từ exon 1 đến exon 3 chỉ bằng 1/2 người bình thường, vì vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon 1 đến exon 3. Phân tích kết quả ở người bố thấy tất cả các đỉnh của gen CYP21A2 đều bình thường chứng tỏ bố không có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 còn người mẹ bệnh nhân cho thấy các đỉnh của exon 1 đến exon 3 chỉ bằng 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ mẹ bệnh nhân là người mang gen bệnh

Kết quả phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia đình MS05:

Hình 3.11. Phả hệ gia đình số 05

Gia đình có con gái (III.1) 8 tuổi bị bệnh TSTTBS thể nam hóa đơn thuần, mang đột biến dị hợp tử đoạn từ exon 1 đến exon 3 và đột biến dị hợp tử I172N trên gen CYP21A2. Bố (II.2) 27 tuổi, mẹ (II.4) 25 tuổi. Em trai (III.2) hoàn toàn bình thường, em gái (III.3) có kiểu gen và kiểu hình tương tự bệnh nhân (III.1). Hai em họ (III.2, III.3) không có biểu hiện bệnh.

Kiểu gen của gia đình số 05

Hình 3.12. Kết quả MLPA của gia đình mã số 05

Hình ảnh (hình 3.12) phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA trên gen CYP21A2 cho thấy ở người bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân các đỉnh từ exon 1 đến exon 4 chỉ bằng 1/2 người bình thường, phân tích kết quả ở người bố thấy các đỉnh của exon 1 đến exon 3 chỉ bằng 1/2 so với người bình thường, còn ở người mẹ chỉ có đỉnh của exon 4 bằng 1/2 người bình thường, từ kết quả của bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử kết hợp xóa đoạn từ exon 1 đến exon 3 và đột biến điểm I172 (probe ở exon 4 thiết kế để phát hiện đột biến I172N), người bố mang gen dị hợp tử xóa đoạn từ exon 1 đến exon 3, người mẹ mang gen dị hợp tử I172N. Phân tích thêm hình ảnh MLPA của em trai và em gái bệnh nhân thấy em trai bệnh nhân hoàn toàn bình thường, còn em gái bệnh nhân mang các đột biến tương tự bệnh nhân.

Kết quả phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia đình MS06:

Hình 3.13. Phả hệ gia đình số 06

Ở thế hệ thứ 3 có 1 con gái 18 tháng, mang đột biến dị hợp xóa đoạn exon 1 đến exon 3 với kiểu hình mất muối. Bố 30 tuổi và mẹ 28 tuổi. Anh trai 5 tuổi không có biểu hiện bệnh. Trong phả hệ không ai bị bệnh giống bệnh nhân.

Kiểu gen của gia đình số 06




Hình 3.14. Kết quả MLPA của gia đình mã số 06

Hình ảnh phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA trên gen CYP21A2 cho thấy ở người bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân các đỉnh từ exon 1 đến exon 3 chỉ bằng 1/2 người bình thường, vì vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp xóa đoạn từ exon 1 đến exon 3. Phân tích kết quả ở người bố thấy các đỉnh của exon 1 đến exon 3 chỉ bằng 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ bố bệnh nhân là người mang gen bệnh, còn hình ảnh MLPA người mẹ bệnh nhân cho thấy tất cả các đỉnh của gen CYP21A2 đều bình thường, chứng tỏ mẹ không có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2.

KẾT LUẬN

Ở nhóm bệnh nhân có đột biến, phát hiện 2/6 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 hoặc exon 1- 8 và 1 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn kết hợp với đột biến I172N dị hợp tử. Các bệnh nhân còn lại mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 hoặc dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 8.

Ở nhóm bố mẹ và các thành viên gia đình bệnh nhân (em trai, em gái), phát hiện 4/6 người bố mang gen và 5/6 người mẹ mang gen, 1 em gái của bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1- 3 kết hợp với đột biến dị hợp tử I172N.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. 
   Nguyễn Thúy Giang (2008), Nghiên cứu sự phát triển thể chất và một số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi trung ương, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường đại học Y Hà Nội.
   
2. 
   Triệu Quốc Khánh (2004), Nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường đại học Y Hà Nội.
   
3. 
   Võ Thị Kim Huệ (2000), Góp phần nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS thiếu enzyme 21- hydroxylase ở trẻ em, Luận án Tiến sĩ khoa học Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
   
4. 
   Trần Kiêm Hảo (2007), Xác định một số đột biến CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21- hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh, Luận án Tiến sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
   
5. 
   Nguyễn Thị Phương Mai, Lý Thanh Hà, Nguyễn Mai Hương và cộng sự (2008), “Xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57(4), tr. 259 - 264.
   
6. 
   Thái Thiên Nam (2001), Phát hiện đột biến gen CYP21 trong tăng sản thượng thận bẩm sinh so thiếu enzym 21-hydroxylase ở trẻ em, Luận văn Thạc sỹ y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội.
   
7. 
   Thái Thiên Nam, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thương Lan (2002), “Phát hiện đột biến gen CYP21 trong tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu enzyme 21-hydroxylase ở trẻ em và gia đình trẻ bị bệnh tại viện Nhi”, Nhi khoa; tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trường Đại học Y Hà Nội.
   
8. 
   Nguyễn Thu Nhạn (1994), “Dậy thì sớm”, Cẩm nang điều trị Nhi khoa. Nhà xuất bản Y học, tr. 245 - 246.
   
9. 
   Nguyễn Thu Nhạn, Cao Quốc Việt, Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thị Phượng, Nguyễn Thị Hoàn, Trần Thị Hòa (1991), “Bệnh rối loạn nội tiết- chuyển hóa và di truyền tại viện bảo vệ sức khỏe trẻ em”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học 10 năm (1981 – 1990), tr. 66 - 75.
   
10. 
    Nguyễn Thị Phượng (1996), “Đặc điểm di truyền của hội chứng sinh dục thượng thận”, Di truyền học và ứng dụng, tr. 1 - 5.
    
11. 
    Nguyễn Thanh Thúy (2010), “Sử dụng kỹ thuật PCR lồng phát hiện AND thai từ huyết thanh mẹ và ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh”, Tạp chí thông tin Y – Dược. Số đặc biệt chào mừng ngày gặp mặt liên viện hàng năm về giảng dạy và nghiên cứu miễn dịch học lần thứ 20, tr. 41 - 45.
    
12. 
    Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
    
13. 
    Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, tr. 28 - 32.
    

14. 
    Aysha H. Khan, Muniba Aban, Jamal Raza (2011), “Ethnic disparity in 21 – hydroxylase gene mutations identified in Pakistani congenital adrenal hyperplasia patients”, BMC Endocrine Disorders, Biomed central, pp.1 - 13.
    
15. 
    Angel. O. K Chan, But. M. W (2011), “Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients”, Steroids, 76, pp. 1057 - 1062.
    
16. 
    Amor M, Parker K.L, Globerman H, New M.I, White P.C (1998), “Mutation in the CYP21B gene (I12172→Asn) cause steroid 21- hydroxylase deficiency”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 1600 - 1604.
    
17. 
    Book C. G. D (2000), “Antenatal Treatment of a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia”, Archive Disease Children Fetal Neonatal Ed, 82, pp. 176 - 181.
    
18. 
    Dorr HG, Sippell WG (1993), “Prenatal dexamethasone treatment in pregnancies at rick for congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency: effect on midgestational amniotic fluid steroid levels”, J Clin Endocrinol Metab 76(1), pp. 117 - 120.
    
19. 
    Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi, (2010), “Novel deletion alleles carrying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Brazilian patients with 21-hydroxylase deficiency”, BMC medical Genetics.
    
20. 
    Fibkielstain P.G, Chen W, Mehta P.S. (2010), "Comprehensive genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency". J Clin Endocrinol Metab, 96 (1), pp. 161 - 172.
    
21. 
    Forest. G. Maguelone (2004), “Recent advances in the diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, Human Reproduction, Vol 10, No6, pp. 469 - 485.
    
22. 
    Gelehrter T.D, Collin F.S (1990), Principles of Medical Genetics, William and Wilkins, pp. 299 - 312.
    
23. 
    Ghizzoni Lucia, Marco Cappa (2011), “Relationship of CYP21A2 genotype and serum 17 – hydroxyprogesterone and cortisol levels in a large cohort of Italian children with premature pubarche”, European Journal of Endocrinology, 165, pp. 307 - 314.
    
24. 
    Higashi Y, Yoshioka H, Yamane M, Gotoh O, Fuji – K.Y. (1986), “Complete Nucleotide Sequence of Two Steroid 21- Hydroxylase Genes Tandemly Arranged in Human Chromosome: A pseudogene and A Genuine Gene”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 2841 - 2845.
    
25. 
    Juan Tian, Guohua Yang (2011), “Molecular diagnosis of two families with classic congenital adrenal hyperplasia”, Gene No, pp. 368 - 89.
    
26. 
    Keegan C. E, Killeen A. A (2001), “An Overview of Molecular Diagnosis of Steroid 21 – Hydroxylase Deficiency”, Journal of Molecular Diagnostics, 3(2), pp. 49 - 53.
    
27. 
    Koppens P.F.J. (2002), “Molecular genetics and epidemiology of steroid 21-hydroxylase deficiency origin of disease- causing mutations”, Optima grafische communicate, Rotterdam, The Netherland.
    
28. 
    Larsen et al (2003), Congenital Adrenal Hyperplasia, Williams textbook of Endocrinology10th ed, pp. 458 - 513.
    
29. 
    Levine L.S. (2000), “Congenital Adrenal Hyperplasia”, Pediatrics in Review, 21 (5), pp. 159 - 169.
    
30. 
    Marie I. New (1998), “Diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasiase”, Annul. Rev. Med, 49, pp. 311 - 328.
    
31. 
    New M.I, Carlson A, Obeid J, Marshall I, Cabrera M.S. (2001), “Prenatal Diagnosis for Congenital Adrenal Hyperplasia in 532 Pregnancies”, The journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 86 (12), pp. 5651 - 5657.
    
32. 
    Nike M. M. L Stikkelbroeck (2003), “CYP21 Gene Mutation Analysis in 198 Patients with 21 – hydroxylase Deficiency in the Netherlands: Six Novel Mutations and a Specific Cluster of Four Mutations”, Jounal. Clin Endocrinol Metab, 88, pp. 3852 - 3859.
    
33. 
    Nils Krone, Felix G (2005), “Functional Characterization of Two Novel Point mutations in the CYP21Gene causing simple virilizing forms of congenital Adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism, 90(1), pp. 445 - 454.
    
34. 
    Paola Concolino (2009), “Multiplex ligation – dependent probe amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene deletions/ duplications in Congenital Adrenal Hyperplasia: First technical report”, Clinical Chimica Acta, 402, Elsevier B.V, pp.164 - 170.
    
35. 
    Paulino.L.C (1999), “Mutation distribution and CYP21/C4 locus variability in Brazilian families with the classical form of 21 – Hydroxylase Deficiency”, Journal Acta Pediatric, 88, pp. 275 - 283.
    
36. 
    Speiser P. W (2005), “The Genetics of Steroid 21 – Hydroxylase Deficiency”, The Endocrinologist, 15 (1), pp. 37 - 41.
    
37. 
    Speiser P.W. (2000), “Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency”, Endocrine Reviews, 21(3), pp. 245 - 291.
    
38. 
    Theodoropoulou M, Barta C, Szoke M, Staub M, Ja’nos S, (2001), “Prenatal Diagnosis of Steroid 21- Hydroxylase Deficiency by Allene – Specific Amplification”, Fetal Diagnosis and Therapy, 16, pp. 237 - 240.
    
39. 
    Vu C.D, Bui P.T, Kate Armstrong (2010), Growing numbers of children with CAH in Vietnam, Abstract submitted for 6^th Congress of APPES.
    
40. 
    Zuzana Vrzalova (2011), “Chimeric CYP21A1P/CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia”, European Journal of Medical Genetics, No 54. pp. 112 - 117.
    
41. 
    White P.C., Grossberger D, Onufer B.J, Chaplin D.D, Dupont B, (1985), “Two genes Encoding Steroid 21- Hydroxylase Are Located Near The Genes Encoding the Fourth Component of Complement in Man”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82. pp. 1089 - 1093.