Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detecơ khối phổ

Phổ khối lượng - MS (mass spectrometry) là phương pháp được sử dụng rộng rãi hiện nay trong nghiên cứu hóa học, môi trường, sinh học, độc học và rất nhiều ngành khoa học khác nhau,...

Nguyên tắc chung của phương pháp là khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có năng lượng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra một hay 2 electron và nó trở thành các ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2

ABC + e → ABC^+* + 2e (1)

ABC + e → ABC⁺² + 3e (2)

Loại ion (1) được gọi là ion gốc hay ion phân tử.

Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các gốc hoặc các phân tử trung hòa khác nhau, quá trình này được gọi là quá trình phân mảnh (fragmentation)

ABC^+* → A⁺ + BC^*

ABC^+* → AB⁺ + C^*

AB⁺ → A⁺ + B

Năng lượng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30-100 eV, cao hơn năng lượng ion hóa phân tử (8-15 eV). Quá trình biến các phân tử trung hòa thành các ion gọi là sự ion hóa. Các ion có khối lượng m và điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng [5]. Việc so sánh phổ khối lượng của chất nghiên cứu với thư viện phổ được lưu giữ trong máy tính sẽ xác định được công thức cấu tạo của chất.

Như vậy với kỹ thuật phân tích GC/MS khi các chất trong hỗn hợp được tách ra khỏi nhau sau khi lần lượt đi ra khỏi cột sắc ký khí chúng đi vào hệ thống khối phổ. Khí mang sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và đi vào vùng chân không để được hút ra ngoài. Chất nghiên cứu sẽ được bắn phá để tạo thành các mảnh ion có số khối khác nhau sau đó sẽ thu được phổ khối lượng của từng chất, từ đó qua thư viện phổ sẽ xác định được công thức cấu tạo của chất.

Phổ hoạt tính sinh học của chất (Biological activity spectra – BAS) mô tả sự sự phức hợp của các hiệu ứng dược lý, sinh lý học và cơ chế hóa sinh của các tác động đặc biệt (đột biến, sinh ung thư, quái thai) có thể biểu lộ trong các tương tác với hệ sinh thái của chất. BAS mô tả thuộc tính bên trong của chất phụ thuộc vào cấu trúc đặc biệt của nó. Một chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau. Một số hoạt tính có thể được tìm thấy trong nghiên cứu lý thuyết, một số hoạt tính được phát hiện ra trong các thử nghiệm lâm sàng, một số hoạt tính được phát hiện trong nhiều năm kể từ khi chúng được sử dụng làm thuốc. Ví dụ như Fluorouracil có 10 hoạt tính được lần lượt khám phá ra kể từ năm 1962 đến 1997 được mô tả ở Bảng 4 [15].

Hoạt tính sinh học là kết quả của sự tương tác giữa hợp chất hóa học với thực thể sinh học. Trong nghiên cứu lâm sàng, thực thể sinh học là con người, trong nghiên cứu tiền lâm sàng nó được thử nghiệm trên cơ thể sống là động vật (in vivo) hoặc thử nghiệm trong ống nghiệm (in vitro). Hoạt tính sinh học phụ thuộc vào những nét đặc trưng của hợp chất (về cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý), thực thể sinh học (loài, tuổi, giới tính, ...) và cách tiến hành nghiên cứu (liều lượng, con đường nghiên cứu,..).

Bảng 4. Hoạt tính sinh học của Fluorouracil [15]

STT	Hoạt tính	Năm tìm ra
	Chống ung thư	1962
	Độc phôi	1966
	Kháng vi rút	1971
	Ức chế tổng hợp Thimidine Tiriphosphate	1971
	Ức chế chuyển hóa RNA	1980
	Ức chế tổng hợp protein	1987
	Điều chỉnh chất chuyển hóa Lipit	1990
	Ức chế miễn dịch	1990
	Ức chế chất chuyển hóa	1991
	Kháng vi rút	1996

Nhiều chất có phổ hoạt tính sinh học rộng với nhiều hiệu ứng khác nhau. Một số hiệu ứng được sử dụng trong điều trị bệnh nhưng cũng có một số hiệu ứng có gây độc. Tổ hợp tất cả các hiệu ứng sinh học của chất gây ra đối với các thực thể sinh học được gọi là phổ hoạt tính sinh học của chất . Phổ hoạt tính sinh học có 4535 hoạt tính sinh học bao gồm các hiệu ứng dược lý cơ bản, cơ chế tác động và các độc tính đặc trưng.

Như vậy để xác định chính xác được hoạt tính sinh học của một chất thì nghiên cứu cuối cùng phải tiến hành đưa chất đó vào thử nghiệm. Tuy nhiên một chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau và có những hoạt tính mà nó chưa có điều kiện được bộc lộ, do vậy các nhà nghiên cứu hóa sinh sẽ gặp rất nhiều khó khăn để tìm ra các hoạt tính bằng con đường thử nghiệm lâm sàng. Vì vậy nếu bằng tính toán mà có thể dự đoán được hoạt tính sinh học của chất thì nó là cơ sở lý thuyết rất quan trọng và giảm bớt được rất nhiều công sức cho các nhà nghiên cứu hóa sinh khi đưa vào thử nghiệm lâm sàng trên sinh vật.

Để dự đoán phổ hoạt tính sinh học của chất (BAS) hiện nay người ta sử dụng phầm mền tính toán PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity=f(Structure)). Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất mới có thể xác định được nếu như chất mới có tác dụng đặc biệt.
Chương 2

MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là:

- Bước đầu xác định, đánh giá mối liên hệ của thành phần chất trong tinh dầu Bạch đàn với một số vấn đề sinh thái môi trường.

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là tinh dầu trong lá của ba loài Bạch đàn: Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis); Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) và Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) được trồng tại miền Bắc Việt Nam. Mỗi một loài Bạch đàn nghiên cứu ở một cấp tuổi và tại một thời điểm nhất định trong năm.

Để thực hiện được các mục tiêu trên đề tài tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1. Khảo sát các phương pháp tách chiết tinh dầu từ lá Bạch đàn;

2. Xác định và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chất chính có trong tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu;

3. Bước đầu đánh giá một số ảnh hưởng của tinh dầu Bạch đàn đến môi trường sinh thái.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu thập và kế thừa tài liệu

Các tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu ở trong và ngoài nước được thu thập, chọn lọc và sử dụng để phân tích, đánh giá thực trạng trồng rừng Bạch đàn ở nước ta. Các nghiên cứu về thành phần và đặc tính tinh dầu Bạch đàn trên thế giới cũng được nghiên cứu sử dụng để so sánh, đánh giá cùng với kết quả nghiên cứu của đề tài. Trong nghiên cứu còn tham khảo các phương pháp phân tích tinh dầu bằng phương pháp phân tích Sắc ký khí và Sắc ký khí ghép nối khối phổ.

Căn cứ vào tài liệu thu thập được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát tại hai địa phương có trồng các loài Bạch đàn đó là thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ thành phố Hà Nội và tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang. Từ đó chọn ra các loài Bạch đàn đặc trưng để lấy mẫu về phòng thí nghiệm tách chiết tinh dầu và phân tích thành phần hóa học của nó. Trước khi lấy mẫu cần tiến hành khảo sát toàn bộ khu vực trồng rừng Bạch đàn. Công việc khảo sát bao gồm quan sát đánh giá một cách định tính sự đa dạng thành phần các loài cây dưới tán.

Tại rừng thực nghiệm của trường Đại học Lâm nghiệp, loài Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) 20 năm tuổi và loài Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) 20 năm tuổi đã được lựa chọn để lấy mẫu nghiên cứu, Hình 2.

Hình 2. Lấy mẫu lá tại rừng thực nghiệm tại Xuân Mai, Hà Nội

Tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) đã được lựa chọn để lấy mẫu lá nghiên cứu.

Mẫu lá của mỗi loài được lấy trên cùng một cây nhưng lấy ở ba tầng khác nhau gồm tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán dưới. Mẫu lá ở mỗi tầng này có số lượng bằng nhau và được tách riêng biệt, đựng trong túi nilon, mã hóa và bảo quản ở nhiệt độ tử 2 - 4^0­­C. Thời điểm tiến hành lấy mẫu nghiên cứu trong tháng 8 năm 2010.

Ngoài mẫu lá đề tài còn tiến hành lấy thêm mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng để nghiên cứu đánh giá tìm hiểu về sự có mặt của các chất hóa học tương ứng với tinh dầu mẫu lá của nó. Mẫu rễ được lấy trên cùng một cây lấy mẫu lá và cũng được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 4⁰C trước khi phân tích.

+ Diclometan, Merck (CHLB Đức);

+ Nước cất 2 lần;

+ Na₂SO₄ khan.

+ Máy sắc ký khí Master GC sử dụng detectơ FID, Italya;

+ Máy sắc ký khí Hewlet Parkard 6890 sử dụng detector MS, Mỹ;

+ Xylanh bơm mẫu dung tích 10 µl, 20 µl;

+ Thiết bị chiết dòng ngưng liên tục;

+ Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước;

+ Cân phân tích có sai số d = 0,1 mg;

+ Bếp ổn nhiệt, nhiệt độ max 300⁰ C;

+ Nhiệt kế có nhiệt độ tối đa 300⁰ C của Nga;

+ Micro pipet 20 μl; 100 μl; 1000 μl;

+ Đá bọt;

+ Lọ đựng mẫu 2 ml.

Dụng cụ dùng cho chuẩn bị mẫu xác định các chất ở lượng vết, máy sắc ký có độ nhạy cao 10^-11- 10^-12g nên để tránh nhiễu kết quả thì khâu chuẩn bị dụng cụ có ý nghĩa rất quan trọng. Tất cả các dụng cụ thủy tinh được làm sạch theo các bước sau:

+ Rửa sạch bằng xà phòng;

+ Tráng nhiều lần bằng nước thường;

+ Tráng 3 lần bằng nước cất 2 lần;

+ Tráng 3 lần bằng dung môi CH­₂Cl₂;

+ Sấy toàn bộ dụng cụ trong tủ sấy ở nhiệt độ 200⁰C trong 2 giờ;

Tất cả các dụng cụ trước khi sử dụng phải được tráng lại nhiều lần bằng bằng dung môi CH₂Cl₂ hoặc n – hexan.

Mẫu lá dùng để phân tích là mẫu tổ hợp của ba loại mẫu lấy ở tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán trộn lại với nhau theo cùng một tỷ lệ. Trước khi phân tích mẫu lá và rễ được rửa bằng nước lạnh rồi được bảo quản trong tủ lạnh sâu có nhiệt độ -18^0­­C.

Đề tài sử dụng hai phương pháp cất lôi cuốn hơi nước và chiết dòng ngưng liên tục để tách chiết tinh dầu trong mẫu nghiên cứu.

Phương pháp này cho phép chiết khá triệt để các chất có mặt trong các bộ phận của cây. Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước tốn ít thời gian, không gây độc đối với môi trường.

Hệ thống cất lôi cuốn hơi nước (Hình 3) gồm hai bình nối tiếp nhau, bình trên đựng mẫu cần chiết, bình dưới đựng nước. Khi đun sôi nước ở nhiệt độ 200⁰C sẽ tạo ra một luồng hơi nước nóng có áp suất cao sục qua mẫu lá làm cuốn đi các thể tinh dầu đến ống sinh hàn. Tại đây hơi nước và tinh dầu được làm lạnh rồi ngưng tụ vào phần thu mẫu tinh dầu. Quá trình phân lớp xảy ra tại đây. Tinh dầu có tỉ khối nhẹ hơn nước nên nổi lên phía trên còn nước chìm xuống phía dưới. Tách nước ta sẽ thu được phần tinh dầu của mẫu nghiên cứu.

Hình 3. Thiết bị cất lôi cuốn hơi nước

Trong suốt quá trình cất tinh dầu nhiệt độ của bếp đun được giữ ổn định ở 200⁰C, hơi nước đo được có nhiệt độ 98⁰C. Đề tài tiến hành cất lôi cuốn trong các khoảng thời gian khác nhau cho các mẫu khác nhau để đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học trong tinh dầu theo thời gian cất, xác định tỉ khối và hàm lượng phần trăm của tinh dầu trong mẫu nghiên cứu. Khối lượng mẫu lá (lá tươi) cho một lần cất hơi nước là 200 g. Thời gian tiến hành cất lôi cuốn hơi nước cho mỗi loại mẫu (mẫu lá Bạch đàn trắng và mẫu lá Bạch đàn xanh) thực hiện trong 5 khoảng thời gian khác nhau, đó là: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ và 5 giờ kể từ lúc nước sôi.

Hệ thống cất dòng ngưng liên tục được bố trí như hình 4.

Hệ thống cất dòng ngưng gồm 2 bình cầu đặt song song cùng nối vào ống sinh hàn. Mẫu lá tổ hợp được cắt nhỏ có kích thước 1x3 cm, cân lấy 5 gam mẫu cho vào bình cầu đựng mẫu (bình 1) và mẫu được ngâm trong nước cất 2 lần đến khoảng 3/5 bình, bình cầu còn lại (bình 2) cho vào 7 ml dung môi điclometan. Cả hai bình cầu này được nối với cùng một ống sinh hàn. Khi đung nóng bình cầu với nhiệt độ của bếp là 100⁰C làm sôi nước trong bình cầu, bình cầu đựng điclometan được cấp nhiệt ở 60⁰C. Hơi nước trong bình cầu đựng mẫu sẽ bay lên cuốn theo cả các phân tử tinh dầu cùng với dung môi điclometan cũng được bay lên và gặp nhau ở bề mặt sinh hàn. Tại đây quá trình chiết bắt đầu xảy ra, tinh dầu sẽ tự động hòa tan vào dung môi điclometan và tách ra khỏi nước. Cả tinh dầu, điclometan và nước được làm lạnh và ngưng lại phần thu. Điclometan nặng hơn nước lên chìm xuống dưới còn nước nổi lên trên. Phần nước sẽ quay ngược lại bình cầu đựng mẫu còn phần điclometan chứa tinh dầu sẽ quay lại bình cầu đựng đựng điclometan. Quá trình cứ thế diễn ra trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào từng nghiên cứu. Mỗi một loài Bạch đàn cũng tiến hành nghiên cứu cất nhiều mẫu của cùng một loài trong các khoảng thời gian khác nhau như phương pháp lôi cuốn hơi nước để khảo sát đánh giá khả năng tách chiết của phương pháp theo thời gian.

Đối với mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng đề tài lựa chọn phương pháp cất dòng ngưng liên tục để nghiên cứu. Khối lượng của mẫu rễ trong mỗi lần chiết là 10 gam, tiến hành chiết liên tục 3 mẫu rồi gộp toàn bộ 3 phần dung thu được thành một mẫu, đem đi làm giầu xuống còn 1,0 ml. Mẫu này được dùng để phân tích trên GC/FID và GC/MS. Tất cả các mẫu thu được trước khi phân tích trên các hệ thống máy sắc ký đều được cho chạy qua cột Na₂SO₄ khan đã được sấy khô để loại nước.

2.4.3.4. Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn

- Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật GC/FID

Đây là phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi để xác định các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, bền nhiệt. Mẫu tinh dầu sau khi tách chiết được hòa tan vào trong dung môi n-hecxan để bơm vào hệ thống sắc ký GC-Master của Italia tại trường Đại học Lâm nghiệp. Phương pháp này sẽ phát hiện được số các hợp chất có trong tinh dầu ở mức hàm lượng rất nhỏ cỡ ppm đến ppb đồng thời sử dụng để khảo sát các chương trình phân tích mẫu trước khi phân tích trên hệ thống GC/MS

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký như sau:

+ Cột mao quản DN 17, nhiệt độ cao nhất 350⁰C, kích thước cột: 30m x 320µm x 0,25 µm (chiều dài x đường kính trong x bề dầy lớp hấp phụ);

+ Chương trình nhiệt độ của cột tách: nhiệt độ ban đầu 60⁰C giữ trong 1 phút, nâng lên đến 90⁰C với tốc độ gia nhiệt 3⁰C/phút, nâng tiếp lên 120⁰C với tốc độ gia nhiệt 15⁰C/phút, nâng tiếp lên 200⁰C với tốc độ gia nhiệt 5⁰C/phút, giữ trong 10 phút;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 250⁰C

+ Nhiệt độ của detectơ: 250⁰C

+ Khí mang: N₂ (99,9999%)

+ Tốc độ dòng khí mang: 1,3 ml/phút

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl

- Phương pháp sắc ký khí với detertơ khối phổ

Đây là phương pháp phân tích hiện đại hiện nay trong việc xác định các hợp chất hóa học hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ khác nhau sau khi được tách ra khỏi nhau bằng kỹ thuật sắc ký sẽ được đưa vào hệ thống khối phổ để xác định khối lượng các mảnh ion được bắn phá trong hệ thống ion hóa, trên cơ sở đó có thể xác định được tên và công thức cấu tạo của chất. Thư viện phổ sẽ giúp xác định công thức cấu tạo của hợp chất cần nghiên cứu.

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký khí khối phổ như sau:

+ Cột mao quản BD-5, 19091z - 413, nhiệt độ cao nhất 355⁰C , kích thước: chiều dài, đường kính trong, bề dầy lớp hấp phụ tương ứng là 30 m, 320 µm, 0,25 µm;

+ Chương trình nhiệt độ cột tách: : nhiệt độ ban đầu 60⁰C giữ trong 1 phút, nâng lên đến 90⁰C với tốc độ gia nhiệt 3⁰C/phút, nâng tiếp lên 120⁰C với tốc độ gia nhiệt 15⁰C/phút, nâng tiếp lên 200⁰C với tốc độ gia nhiệt 5⁰C/phút, giữ trong 10 phút;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 250⁰C;

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24;

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl;

+ Sử dụng chế độ đo chọn lọc ion;

+ Ion hóa chất theo nguyên tắc va đập điện tử.

2.4.4. Phương pháp tin sinh học dự đoán hoạt tính sinh học của chất

Việc sử dụng phần mềm Phổ dự đoán hoạt tính sinh học của chất - PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity = f(Structure). Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất cần nghiên cứu có thể xác định được.

Trong cơ sở dữ liệu của PASS bao gồm khoảng 46000 hợp chất có hoạt tính sinh học, trong đó khoảng 16000 chất đã được sử dụng làm thuốc, 30000 chất đang được đề nghị cho kiểm tra lâm sàng hoặc tiền lâm sàng.

Hình 2.4. Sơ đồ quá trình phát triển của PASS

Sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước để xác định khối lượng (tính trên mẫu lá tươi) và tỉ khối của tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu.

Đối với mỗi loài Bạch đàn đề tài đã khảo sát hiệu quả của phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian. Kết quả nghiên cứu được nêu trong các Bảng 5, Bảng 6 và Bảng 7.

Đối với loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) trồng tại Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, thành phố Hà Nội được thu hái vào ngày 2 tháng 8 năm 2010, kết quả nghiên cứu được mô tả trong Bảng 5.

Qua bảng số liệu trên nhận thấy với thời gian chiết là 4 giờ thì tỷ lệ % về khối lượng của tinh dầu trên khối lượng lá tươi đạt giá trị cực đạt là 0,5316%, tỉ khối của tinh dầu đạt cực đại ở thời gian này, điều đó chứng tỏ rằng những cấu tử nhẹ sẽ được lôi cuốn đi trước mặc dù sự thay đổi này là không đáng kể.

Đối với loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) trồng tại xã Trường Sơn, huyện Lục Lam, tỉnh Bắc Giang được thu hái vào ngày 10 tháng 8 năm 2010, kết quả nghiên cứu được mô tả trong Bảng 6.