Nghiên cứu giá trị VÀ Ứng dụng của các kỹ thuật chẩN ĐOÁn nấm men gây bệNH

Trong đó có 3 mẫu chỉ đủ để nuôi cấy trên môi trường thạch bột ngô và chỉ định danh được là Candida non albicans do đó chỉ có 61 mẫu để so sánh TNSÔM.

Trong 202 người được khám và phỏng vấn có 81 người có thương tổn trong đó nam là 7 chiếm tỷ lệ 25,00%, nữ là 74 chiếm tỷ lệ 42,53%. Kết quả trình bày ở Bảng 1 cho thấy độ tuổi mắc bệnh cao nhất là 20 - 29 tuổi cũng tương tự nghiên cứu của Lâm Văn Cấp và cao ở độ tuổi lao động [3]. Về đặc điểm giới tính thì tỷ lệ nữ có thương tổn nhiều hơn nam, nhưng không có ý nghĩa thống kê ( p > 0,05), cũng giống như nghiên cứu của Loannidou năm 2006 ở đảo Crete, Hy lạp [15].

Liên hệ với nghiên cứu của Lâm Văn Cấp thì thương tổn gặp ở nữ nhiều hơn nam có ý nghĩa thống kê là do đối tượng nghiên cứu ở đây khác với chúng tôi, là những người đến khám tại Viện Da liễu, thì tỷ lệ VQM - VM thường gặp ở nữ hơn nam, cũng như nghiên cứu Ponte ở Brasil [16]. Theo chúng tôi, VQM - VM mang tính chất nghề nghiệp nên nữ mắc nhiều hơn nam chứ bệnh không có sự khác biệt về giới tính. Nghiên cứu của Alvarez ở Colombia [7], Weinberg ở New York [21], Ellabis ở Libăng [9] cũng ghi nhận: nấm men gây bệnh nấm móng thường gặp ở phụ nữ hơn nam giới trong khi đó tác nhân nấm da lại thường gặp ở nam hơn nữ, cũng như ghi nhận của Badillet ở Pháp [22], Sayed ở Libăng [19]. Trong khi đó nghiên cứu của Sigurgeisson ở Iceland về tình hình nhiễm nấm móng trên đối tượng trẻ em từ 0 - 17 tuổi thì không đề cập đến sự khác biệt về giới tính [21]. Phối hợp với nghiên cứu của chúng tôi giúp khẳng định: sở dĩ bệnh gặp nhiều ở nữ là do yếu tố nghề nghiệp làm việc mà tay thường xuyên tiếp xúc với nước [6].

2. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NẤM MEN ĐỂ XÁC ĐỊNH LOÀI NẤM GÂY BỆNH

2.1. Kết quả xét nghiệm nấm trực tiếp

Kết quả xét nghiệm nấm trực tiếp (Bảng 2) cho thấy xét nghiệm trực tiếp chẩn đoán tốt nhiễm nấm móng, với tỷ lệ có tổn thương lâm sàng xét nghiệm dương tính đến 83,95% trường hợp. Giá trị của xét nghiệm nấm trực tiếp trong chẩn đoán bệnh nấm luôn được y văn nhấn mạnh: xét nghiệm nấm trực tiếp nhanh và đáng tin cậy trong chẩn đoán nấm móng (Gupta AK) [14]. Nhất là Candida là một loại nấm hoại sinh trên cơ thể người, thì nuôi cấy ít có giá trị chẩn đoán viêm quanh móng - viêm móng (VQM - VM) do Candida [2].Tuy nhiên điều quan trọng là kết quả được đọc bởi kỹ thuật viên và bác sĩ chuyên khoa giàu kinh nghiệm và các bước kỹ thuật lấy bệnh phẩm làm tiêu bản phải luôn luôn được tiến hành cẩn thận đúng quy trình, khi kết quả nghi ngờ phải làm lại hoặc phối hợp với khám lâm sàng để cho kết quả chính xác. Theo Trần Xuân Mai thì khoảng 30% mẫu móng lấy từ những người rất nghi ngờ nhiễm nấm nhưng xét nghiệm nấm trực tiếp (XNNTT) và nuôi cấy đều âm tính [2]. Điều này một lần nữa cho thấy: lấy bệnh phẩm đúng vị trí rất quan trọng trong xét nghiệm chẩn đoán bệnh nấm móng. Giá trị của xét nghiệm nấm trực tiếp ghi nhận từ hình ảnh nghiên cứu của chúng tôi ( Hình 1).

Nghiên cứu của Evangeline về bệnh nấm da và nấm ngoại biên ở Philippine ghi nhận: có đến 25% mẫu xét nghiệm nấm trực tiếp với dung dịch KOH 20% (như chúng tôi đã thực hiện), nhưng nuôi cấy âm tính [10]. Thực tế là như vậy, XNNTT cho chẩn đoán tốt bệnh nấm cho dù không định danh được loài nấm. Hơn nữa XNNTT rất có giá trị trong chẩn đoán bệnh nấm nông trong khi mà các chẩn đoán phản ứng trùng phân chuỗi và dùng đầu dò DNA đang rất phát triển thì chưa có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán bệnh nấm

[10]. Hơn nữa Bảng 4 cho thấy kết quả xét nghiệm nấm trực và nuôi cấy của chúng tôi tương đối phù hợp tốt với nhau với hệ số kappa là 0,837, chỉ có 4 trường hợp xét nghiệm trực tiếp dương tính nhưng nuôi cấy không mọc (Bảng 3.17) chiếm tỷ lệ 5,89%. Bên cạnh đó có 12 mẫu nuôi cấy bị tạp nhiễm chiếm tỷ lệ 17,54% ( 10,29% và 7.25% ở Bảng 3).

Evangeline cũng ghi nhận trong nghiên cứu của ông: có 7,75% mẫu nuôi cấy nấm da và nấm ngoại biên bị nhiễm tạp nấm [10]. Đây là một vấn đề cần lưu ý trong quá trình nuôi cấy nấm cần kết hợp với lâm sàng và xét nghiệm trực tiếp cũng như cẩn thận trong các thao tác lấy bệnh phẩm để tránh sự nhầm lẫn. Chính vì thế chúng tôi đã làm lại xét nghiệm để đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm nhưng chỉ được 5 mẫu (7,35%), còn 7 trường hợp còn lại tuy tạp nhiễm nhưng vẫn định danh được, do không gặp lại được người nhiễm bởi tính chất tạm thời của công việc. Hơn nữa môi trường môi cấy chọn lựa là môi trường Sabouraud chloramphenicol chứ không có actidion (actidion ức chế một số loài Candida) [24], đây chính là một điểm hạn chế của quá trình định danh nấm này. Hạn chế của nuôi cấy nấm, một lần nữa cho thấy tầm quan trọng của XNNTT trong chẩn đoán bệnh nấm móng. Để khắc phục nhược điểm này, một lần nữa cần lưu ý trong quá trình lấy bệnh phẩm và thao tác kỹ thuật phải tuyệt đối vô khuẩn. Vấn đề này đôi khi khó đảm bảo đối với nghiên cứu thực hiện ở cộng đồng.

Xét nghiệm nấm trực tiếp tuy không phân biệt được nấm da và nấm sợi, nhưng đối với VQM-VM do Candida thì rất có giá trị chẩn đoán bệnh nguyên và có lẽ là có giá trị tuyệt đối nếu không kể đến các chẩn đoán miễn dịch học thường chỉ áp dụng đối với bệnh nấm Candida sâu. Tuy nhiên nấm Candida có rất nhiều loại hoại sinh trên da, trong môi trường thức ăn ngũ cốc, trái cây...[3], thì việc nuôi cấy phân lập loài Candida gây bệnh VQM cũng là một điều thú vị và cần thiết để xác định chính xác bệnh nguyên. Không chỉ như thế, ngày nay với sự nổi trội của các loại nấm hoại sinh gây bệnh cơ hội và sự đề kháng với thuốc kháng nấm thì việc định danh lại càng cần thiết [8]. Để định danh Candida, thông thường sử dụng kỹ thuật chẩn đoán nhanh Candida albicans bằng thử nghiệm sinh ống mầm (test de germination), hay thử nghiệm mầm giá đậu [5], có tác giả còn gọi là thử nghiệm huyết thanh (Serum culture method) [2], [13] hay còn gọi là thử nghiệm Tacshdijan [22], [24] có thể cho chẩn đoán đến 86% trường hợp nhiễm Candida albicans và 90% bệnh nguyên bệnh nấm Candida sp. (do 90% bệnh nấm Candida là do Candida albicans ) [20], [23], rồi định danh các loài Candida non albicans bằng phản ứng sinh vật hoá học như chúng tôi đã thực hiện.

Thử nghiệm Tacshdijan có thể dùng huyết thanh người hoặc súc vật, lòng trắng trứng hoặc trypticase soya (Bertina) [8], [23]. Đa số các y văn và nghiên cứu đều dùng huyết thanh, mặc dầu huyết thanh người được ghi nhận là: có feritin làm ức chế sinh ống mầm, dễ nhiễm các mầm bệnh từ máu (Ví dụ nhiễm virus HIV hoặc virus HBV), huyết thanh súc vật thì dễ nhiễm khuẩn nên ức chế khả năng sinh ống mầm. Trong lúc đó sử dụng lòng trắng trứng hoàn toàn có thể loại bỏ các nhược điểm trên mà lại dễ kiếm, dễ bảo quản. Hơn nữa từ kết quả Bảng 5, 6 và 7 thì lòng trắng trứng có thể thay thế huyết thanh trong kỹ thuật này với hệ số kappa lần lượt là 0,662; 0,698; 0,699. Kết quả này cũng phù hợp với ghi nhận của Koenig cho rằng TNSÔM cho phép chẩn đoán khoảng 86% trường hợp nhiễm C. albicans, nếu muốn chẩn đoán chắc chắn phải nuôi cấy trên môi trường CA theo kỹ thuật Dalmau hoặc môi trường khoai tây cà rốt mật (PCB) để tìm bào tử bao dày như chúng tôi đã thực hiện [13], [24].

Từ phân tích trên và kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: phản ứng sinh ống mầm sử dụng lòng trắng trứng cho chẩn đoán tốt và nhanh C. albicans có thể áp dụng trong thực tế nhất, dùng để thay thế huyết thanh có nhiều yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả và có thể làm gây nhiễm các bệnh truyền qua đường máu cho người thao tác kỹ thuật. Giá trị của phản ứng là có khả năng chẩn đoán có thể đến 90% bệnh nguyên nấm Candida gây bệnh [23]. Khi kết quả âm tính thì sẽ định danh bằng phản ứng sinh hoá đánh giá khả năng sử dụng các loại đường khác nhau của nấm men và/hoặc phối hợp nuôi cấy trên môi trường thạch bột ngô nếu cần, như vậy sẽ có lợi về thời gian, kinh tế và an toàn hơn cho người thực hiện.

Giá trị ứng dụng của phản ứng sinh ống mầm với lòng trắng trứng càng được nhấn mạnh bởi hình ảnh ghi từ nghiên cứu chúng tôi (hình 2 và 3) và tầm quan trọng của việc chẩn đoán bệnh nguyên nhiễm trùng huyết do nấm men ở nước ta [4]. Hơn thế nữa, ngay cả nghiên cứu ở các nước như: nghiên cứu của Queshi ở Michigan Hoa kỳ năm 2004, nghiên cứu của Foster ở Alabama Hoa kỳ năm 2004 cũng không xác định loài Candida non albicans nào trong bệnh nguyên bệnh nấm móng [12], [17] mà chỉ dùng TNSÔM để định danh ngang mức Candida albicans và Candida non albicans.

Đánh giá kỹ thuật Dalmau, chúng tôi nhận thấy: đây là một kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả tốt chẩn đoán C. albicans, C. non albicans và nấm men khác phù hợp với phản ứng sinh vật hoá học và được ghi nhận từ nhiều tác giả trong và ngoài nước, như: Đỗ thị Nhuận, Bertina, Glenn, Drouhet và Koenig [8], [13], [23], [24]. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi phải nuôi cấy qua nhiều môi trường, mất nhiều thời gian do đó ít có giá trị thực tiễn. Trong lúc đó phản ứng sinh vật hoá học đánh giá khả năng sử dụng các loại đường khác nhau của các chủng nấm khác nhau là một thử nghiệm phức tạp và kết quả thường cũng phải chẩn đoán phối hợp với đánh giá từ kỹ thuật Dalmau và nuôi cấy trên môi trường SC để khảo sát các tiêu chuẩn hình thái (như khuyến cáo của nhà sản xuất) mới cho kết quả chính xác. Do đó thường chỉ áp dụng cho nghiên cứu và phải phối hợp vơí nuôi cấy trên môi trường SC và kỹ thuật Dalmau.

Tóm lại TNSÔM dùng lòng trắng trứng (LTT) thay cho huyết thanh (HT) có thể áp dụng được trong chẩn đoán nhanh C.albicans trong thực tiễn vừa dễ thực hiện, an toàn và cho kết quả tốt.

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu trên 202 người làm việc thường xuyên ẩm ướt tay tại các quán ăn uống giải khát của hai Phường Phú Cát và Phường Vĩnh Ninh Thành phố Huế, có 81 người có tổn thương móng, chiếm tỷ lệ 40,10%; trong đó có 64 (79,01%) người nhiễm nấm móng được làm các xét nghiệm định danh nấm men , chúng tôi rút ra các kết luận sau:

1. Xét nghiệm nấm trực tiếp cho phép chẩn đoán nhanh đáng tin cậy để chẩn đoán tổn thương móng do nấm. Sau khi chẩn đoán C. albicans có thể dùng kỹ thuật Dalmau và các phản ứng sinh vật hoá học khác để chẩn đoán các tác nhân nấm men C. non albicans và nấm men gây bệnh ít gặp khác.

2. Có thể dùng lòng trắng trứng thay thế cho huyết thanh trong phản ứng sinh ống mầm để định danh nhanh Candida albicans. Kỹ thuật này cho kết quả đáng tin cậy với độ phù hợp khá khi so sánh với TNSÔM với HT và kỹ thuật Dalmau ( hệ số Kappa lần lượt là 0,805 và 0,699), dễ thực hiện và an toàn.

KIẾN NGHỊ

Có thể thay thế huyết thanh người hoặc súc vật thí nghiệm bằng lòng trắng trứng trong phản ứng sinh ống mầm chẩn đoán nhanh Candida albicans.

1. Tôn Nữ Phương Anh, Ngô Thị Minh Châu, Nguyễn Thị Hoá (2006),” Tình hình nhiễm nấm móng ở người làm việc tại các quán hàng ăn uống giải khát phường Phú cát -TP Huế”, Tạp chí Y học thực hành 3(537), tr.33-37.

2. 
   Bộ môn Ký sinh trùng, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh (2002). Ký sinh trùng y học, NXB Đà Nẵng, tr. 442-448.
   
3. 
   Lâm Văn Cấp (2001), Tình hình, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và một số yếu tố liên quan tới viêm quanh móng do Candida khám tại Viện Da liễu từ năm 1996-2001, Luận văn Thạc sĩ Y học chuyên ngành Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội.
   
4. 
   Hà Mai Dung (2001), “Nấm men - tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết cần chú ý ở những bệnh nhân nằm viện”, Tạp chí Y học TP HCM, 5(1), tr.58-62.
   
5. 
   Hoàng Thuỷ Long (1991), Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh vật Y học, NXB Văn hoá, tr.302-307.
   
6. 
   Alcamo EI. (1991), Microbiology, The Benjamin/ Cummings Publishing Company, pp.470-488.
   
7. 
   Alvarez MI, Gonzalez LA, Castro LA (2004). “Onychomycosis in Cali, Colombia”, Mycopathologia; 158(2), pp.181-6.
   
8. 
   Bertina B.W. (1988), Diagnostic procedure for mycotic and parasitic infections, APHA, USA, pp.1- 30, 239-257.
   
9. 
   Ellabib MS, Agaj M, Khalifa Z, Kavanagh K (2002). “Yeasts of the genus Candida are the dominant cause of onychomycosis in Libyan women but not men: results of a 2-year surveillance study”. Br J Dermatol;146(6), pp.1038-41.
   
10. 
    Evangeline B., Dayrit H. and J. (2005), “Mycology in the Philippines, revisted“, Jpn. J. Med. Mycol. 46, pp.71-76.
    
11. 
    Fitzpatrick B.T. (2001), Color atlas and synopsis of clinical dermatology, common and serious diseases, McGraw- Hill, Medical publishing Division, pp.708-709.
    
12. 
    Foster KW, Ghannoum MA, Elewski BE (2004). “Epidemiologic surveillance of cutaneous fungal infection in the United States from 1999 to 2002”. J Am Acad Dermatol, 50(5), pp.748-52.
    
13. 
    Glenn SB. (1995), Fungus diseases in the Orient, Rex Book Store, Manila Philippines, pp.123-129, 225-250.
    
14. 
    Gupta AK., Ryder JE., Summerbell RC. (2004), “Onychomycosis: classification and diagnosis“, J Drugs Dermatol. 3(1),pp.51-56.
    
15. 
    Loanidou DJ., Maraki S., Krasagakis SK., Tosca A., Tselentis Y. (2006), “The epidemiology of onychomycoses in Crete, Greece, between 1992 and 2001“, JEADV 20, pp.170-174.
    
16. 
    Ponte ZB., Lima Ede O., et al. (2002), “Onychomycosis in Jalo Pessoa City, Brasil“, Rev Argent Microbiol 34(2), pp.95-99.
    
17. 
    Qureshi HS. Ormsby HA, Kapadia N. (2004), “Effects of modified sample collection technique on fungal culture yied: nail clipping/ scraping versus microdrill”, J Pak Med Assoc. 54(6), pp.301-305.
    
18. 
    Sigurgeirsson B., Kristinsson KG., Jonason PS. (2006), “Onychomycosis in Icelandic children”, Journal of European Academy of Dermatology and Venereology 20, pp.1-4.
    
19. 
    Sayed FE., Ammoury, Haybe RF., Dhaybi R. (2006), “Onychomycosis in Lebanon: a mycological survey of 772 patients“, Mycose 49, pp.216-219.
    
20. 
    Walker TS. (1998), Microbiology, W. B. Saunders Company, pp.290-317.
    
21. 
    Weinberg JM., Scheinfeld NS. (2003), “Cutanneous infections in the elderly: diagnosis and management“, Dermatol Ther. 16(3), pp.195-205.
    
22. 
    Badillet G. (1986), Champignons contaminant des cultures. Champignons opportunistes. Atlas clinique et biologie. Tome 1., Varia, Paris, pp.27 - 85.
    
23. 
    Drouhet E. (1987), Candidose-Geotrichoses-Pityrosporoses-Piedras blanches, Institut Pasteur, Paris, pp.1-8.
    
24. 
    Koenig H. (1995), Guide de Mycologie médicale, Ellipses, pp.13-82.