Các phương pháp xác định amoni [4, 15]

1.2.2. Phương pháp điện cực chọn lọc

Mẫu sau khi đã được đệm hóa ở pH 9,5 và chưng cất, được hấp thụ vào 50 ml dung dịch H₂ SO₄ 0,04N đối với phương pháp điện cực chọn lọc và phương pháp phenat.

Điện cực chọn lọc amoni sử dụng một màng thấm kị khí để tách dung dịch mẫu khỏi một dung dịch NH₄Cl trong điện cực. Amoni hòa tan (NH₃ và NH₄⁺) được chuyển thành NH₃ nhờ tăng pH đến 11 bằng một dung dịch kiềm mạnh. NH₃ sẽ khuếch tán qua màng và làm thay đổi pH. Sự thay đổi pH này được đo bằng một điện cực pH.

1.2.3. Phương pháp trắc quang

Qua nhiều năm, các phương pháp trắc quang khác nhau để xác định amoni đã được sử dụng. Những phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất là dựa vào phản ứng hóa học tạo phức màu với các thuốc thử vô cơ (Nessler) hoặc thuốc thử hữu cơ (màu xanh indo-) của ion amoni trong môi trường kiềm.

Nguyên tắc của phương pháp là khi thuốc thử Nessler (K₂HgI₄) trong môi trường kiềm được thêm vào một dung dịch muối amoni loãng, thì amoni sẽ nhanh chóng phản ứng với thuốc thử, tạo phức có màu vàng đến nâu sẫm phụ thuộc vào nồng độ amoni có trong mẫu. Màu tạo ra giữa thuốc thử Nessler và amoni có cực đại hấp thụ quang ở bước sóng 420 - 500 nm tùy thuộc vào nồng độ amoni trong mẫu.

Đây là phương pháp khá nhạy, có thể xác định được lượng amoni (tính theo N) từ 0,02 mg/l đến 5,00 mg/l. Các yếu tố ảnh hưởng có thể loại trừ bằng cách kết tủa với kẽm hydroxit hoặc chưng cất trước khi nessler hóa.

Thuốc thử Nessler được sử dụng để xác định amoni trong dung dịch amoni rất loãng và trong nước tự nhiên. Phương pháp cũng được ứng dụng để xác định nitrat và nitrit bằng cách khử chúng trong môi trường kiềm có hợp kim Devarda làm xúc tác tới amoniac; thu các nitrat và nitrit đã bị khử về dạng NH₃ bằng cách chưng cất. Quy trình này được ứng dụng với nồng độ amoni <0,1 mg/l.

Phương pháp phenat dựa trên phản ứng tạo phức màu xanh đậm indophenol – giữa amoni, phenol và hypoclorit nhờ sự xúc tác của muối Mn(II). Phương pháp có thể xác định tới 0,01 đến 0,50 mg NH₄⁺-N/l.

Dùng thuốc thử phenat, người ta có thể xác định được cả nitơ trong các loại nước tự nhiên (nước nguồn) và cả nitơ trong nước cống bằng phương pháp trắc quang. Khoảng nồng độ của nó tuyến tính đến 0,6 mg NH₃-N/l.Các yếu tố ảnh hưởng có thể loại bằng cách chưng cất vào chất hấp thụ là H₂SO₄.

Ngoài ra, còn có phương pháp phenat tự động được ứng dụng trên khoảng nồng độ từ 0,02-2,0 NH₃-N/l.

Độ kiềm quá 200 mg/l (tính theo CaCO₃) và độ axit lớn hơn 100 mg/l (tính theo CaCO₃), cũng như độ đục sẽ ảnh hưởng đến phép xác định. Việc loại trừ ảnh hưởng này có thể thực hiện bằng cách chưng cất trước.

Ngoài ba phương pháp chủ yếu trên, các phương pháp phân tích dòng chảy (FIA), sắc ký ion (IC), phương pháp enzym, phân tích dòng liên tục (sequential injection analysis-SIA) và sắc ký khí – khối phổ (GC/MS) cũng được sử dụng để xác định amoni trong nước.

Như trên (mục 1.2) đã trình bày “việc xác định hàm lượng amoni đã trở thành một nhiệm vụ khá quan trọng trong phân tích môi trường, đặc biệt là phân tích nước”, tuy nhiên việc phân tích amoni trong các đối tượng môi trường thường mất nhiều thời gian, thiết bị phải chuyên dụng và quy trình phức tạp do phải xử lý làm giàu, loại các ảnh hưởng, ... Thêm nữa, độ chính xác của phương pháp xác định nitơ-amoni phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu và xử lý bảo quản mẫu; mẫu chưa được phân tích ngay thường tạo ra sai số do sự chuyển hóa sang các dạng chứa nitơ khác. Vì thế đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu, tìm cách có thể xác định ngay và nhanh nồng độ amoni, đặc biệt là amoni trong môi trường nước và không khí. Các nghiên cứu này đa phần sử dụng phương pháp quang, hoặc trên cơ sở phương pháp quang chế tạo các sensơ nhạy amoni, chiết điểm sương phức màu indophenol, ... Dưới đây là một số công trình tiêu biểu.

Năm 1992 W. Sellien và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo một sensơ quang hóa để quan trắc ion amoni trong các dung dịch nước. Các tính chất của sensơ dựa trên một chỉ thị pH không thay đổi. Giới hạn phát hiện của sensơ phụ thuộc vào giá trị pK_a của chỉ thị pH đã sử dụng và vào pH cũng như nhiệt độ của mẫu. Với p-xylenol xanh (pK_a = 2,0), giới hạn phát hiện là 1.10^-6 M/L NH₄⁺ (pH = 6,8; t^o = 22^oC). Thời gian đáp ứng phụ thuộc vào nồng độ ion amoni và dao động từ 1 đến 60 phút. Độ bền của sensơ > 6 tháng. Sensơ được tối ưu hóa để phân tích nước thải mà không cần tiền xử lý mẫu. Nồng độ amoni đo được phù hợp với các kết quả phân tích bằng những phương pháp truyền thống khác [33].

Martina Trinkel và các đồng nghiệp (1996) đã nghiên cứu chế tạo sensơ quang cho xác định amoniac trên cơ sở cặp ion (thuốc nhuộm nhạy pH (bromophenol xanh) được cố định như một cặp ion liên hợp với cetyltrimethylammonium trong nền silicon) [25]. Màu của thuốc nhuộm thay đổi từ vàng đến xanh theo sự tăng nồng độ amoni trong mẫu. Nồng độ amoni được đo theo độ truyền qua ở một bước sóng xác định. Tất cả các phép đo được thực hiện với một chùm sáng kép, máy đo quang trạng thái rắn. Khoảng đo dao động từ 6.10^-7 đến 1.10^-3 M (0,01 ÷ 17 µg/L) trong đệm phosphat natri 0,1M, pH 8. Thời gian đáp ứng 90% và 100% ở tốc độ dòng 2,5 ml/ph là 4 phút và 10 phút, cho một sự thay đổi từ 41,9 ÷ 82,5 µM amoni; hoặc 12 và 48 phút cho sự thay đổi từ 160 ÷ 0 µM amoni. Độ ổn định của phép đo bị hạn chế bởi tín hiệu nền và độ nhạy amoni. Sensơ sử dụng tốt trong khoảng thời gian một vài ngày. Độ bền lưu kho là > 10 tháng (khô). Không bị ảnh hưởng của pH trong khoảng từ 5 đến 9. Hiệu quả sử dụng của sensơ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các amin và các chất tảy rửa cation. Sensơ có thể được làm sạch lại bằng H₂O₂ 3% hoặc sấy khô (90^oC).

King Tong Lau và cộng sự (2004) đã chế tạo được sensơ amoni rắn trên cơ sở sử dụng phương pháp tạo màu indophenol, cho phép tốc độ hình thành màu nhanh hơn so với sensơ loại này đã biết trước đây. Nhiệt độ trong quá trình xác định màu ở khoảng 20^oC; độ tuyến tính của phép đo nằm trong khoảng nồng độ từ 1÷ 10 ppm. Ý tưởng về một hệ thống bán tự động bao gồm một camera kỹ thuật số đen trắng được chiếu sáng bằng đèn LED màu đỏ, xanh lá cây và xanh da trời để đo độ đáp ứng của sensor [21].

Năm 2005, Joon-Shik Park và cộng sự [28] cũng đã đưa ra ý tưởng và chế tạo thành công những vi hệ thống phân tích tích hợp amoni (IMAAS) có bình phản ứng nhỏ và detector quang đẳng diện kèm bộ vi chia dòng. Sử dụng quy trình MEMS để chế tạo IMAAS có kích thước 5 cm x 5 cm và dày 1 mm. IMAAS được nối với đầu vào và đầu ra, sợi quang học nối với nguồn sáng đẳng diện và detector quang UV liên kết epoxy. Tốc độ phản ứng chuyển hóa amoni để hình thành indophenol trong IMAAS được tăng lên nhờ nhiệt độ. Trong trường hợp phản ứng ở 318^oK, thời gian phản ứng < 1 phút, phù hợp tốt cho việc phân tích amoni hiện trường. Trong tương lai, nhóm tác giả mong muốn sẽ chế tạo những hệ thống nhỏ kiểu này để phân tích linh hoạt các chất khác cũng như để xác định tổng cộng cả nitơ hữu cơ và nitơ amoni.

Chúng ta cũng biết rõ là việc đánh giá nồng độ các ion nitrat và amoni trong nước ngầm bị nhiễm bẩn bởi các nguồn nước thải là cực kỳ quan trọng. Những xác định này thường được thực hiện trong phòng thí nghiệm sử dụng thiết bị hiện đại và tinh sảo trong khoảng thời gian từ 2 giờ đến 3 ngày. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta cần có kết quả nhanh và tại chỗ. Bởi thế việc xác định được nhanh cả nitrat và amoni là rất cần thiết nhờ sử dụng một test kit hiện trường amoni (LaMotte, Chestertown, MD). Test được chế tạo sử dụng khả năng khử của TiCl₃ mà có thể chuyển ion nitrat (đến 15 ppm) sang amoni (Braunstein, et al, 1980). Nitrat đã khử bằng TiCl₃ không cần dùng bột Cd độc nữa. Bởi thế phương pháp có khả năng xác định ion nitrat và ion amoni lần lượt sử dụng test kit hiện trường amoni. Nồng độ test kit hiện trường cho kết quả tốt tương đương phòng thí nghiệm (R² = 0,85 và 0,89) và độ phân tán (độ lệch chuẩn) giữa 2 phương pháp là nhỏ, chứng tỏ test kit là phương pháp hiện trường chấp nhận được [16].

Với thuốc thử Nessler, đã được sử dụng từ rất lâu để xác định N-amoni trong các loại nước khác nhau [21, 33], thì trong quy trình phân tích nước uống chỉ cần nước cất không amoni là đủ nhạy, nhanh và đơn giản. Tuy nhiên, người ta vẫn tìm thấy những ảnh hưởng khác nhau của nền mẫu đến kết quả phân tích. Những ảnh hưởng này, trước tiên phải nói đến sự xuất hiện các hợp chất cloramin vô cơ và clo dư của nước uống sau khử trùng clo. Mặc dù đã có khuyến cáo phải khử hết cloramin và clo dư ra khỏi mẫu trước khi cho thuốc thử Nessler bằng một lượng thisulphat tương đương (được tính toán nhờ việc sử dụng dữ liệu xác định clo có sẵn trong một mẫu nước riêng – theo GOST 4129). Nhưng những kiểm tra sơ bộ đã cho thấy việc khuyến cáo này là sai lầm. Theo nghiên cứu của L. N. Demutskaya and I. E. Kalinichenko (công bố tháng 4. 2010), phân tích nước uống đã khử trùng bằng clo theo phương pháp Nessler cũng phải được cải tiến [24].

Hay như phương pháp Nessler chuẩn khuyến cáo đo quang ở hai bước sóng khác nhau phụ thuộc vào nồng độ amoni trong mẫu (< 5 mg/L đo ở khoảng 420 nm và > 5 mg/L đo ở 500 nm) [15] và đo độ hấp thụ quang (trước và sau khi phá hủy phức màu bằng axit thioglycolic) có thể xác định được N-amoni trong các mẫu nước tự nhiên có nồng độ axit humic cao mà không cần xử lý đặc biệt mẫu [24]. Lý do của những khuyến cáo này là việc cho rằng sự hình thành các sản phẩm màu khác nhau của tetraiodo thủy ngân với ion amoni trong môi trường kiềm [15]. Nhưng thực ra, màu quan sát được trong trường hợp này là do phức polime tan của Hg [24] chứ không phải là màu của những hạt keo mịn như những công bố trước đây [21, 33]. Các sản phẩm chính của sự tương tác này là các phức màu polime của thủy ngân (II) chứa N-nitrua, iodua và ion OH^-, được hình thành trong quá trình tự xúc tác phức tạp [23].

Mặt khác, đã biết rằng việc xác định N-amoni bằng thuốc thử Nessler thường bị ảnh hưởng bởi các amin béo và thơm, các cloramin hữu cơ, các ancol, các andehyt, xeton và các hợp chất khác [15, 23] làm ảnh hưởng đến màu của phức giữa thuốc thử Nessler và ion amoni, đồng thời gây đục. Nên trong quá trình phân tích, các mẫu nước chứa hàm lượng các hợp chất trên cao thường phải được tách thu amoniac nhờ chưng cất Kjeldahl. Tương tự để loại bỏ các ảnh hưởng gây đục, khi phân tích amoni trong nước uống, tatrat được cho vào để tạo phức tan với Ca, Mg và Fe(III) trong môi trường kiềm. Chính vì vậy, những nghiên cứu nhằm tạo điều kiện xác định nhanh và ngay amoni trên hiện trường vẫn luôn được tìm kiếm và phát triển, cải tiến.

Đến năm 1999, Minoru OKUMURA và các đồng nghiệp của ông đã nghiên cứu và công bố công trình sử dụng phương pháp trắc quang và so màu bằng mắt đơn giản để xác định nitơ-amoni trong nước. Phương pháp được đề xuất dựa trên sự phát triển màu xanh indothymol hình thành giữa NH₄⁺ và thymol. Sự phát triển màu được tăng nhanh nhờ xúc tác nitroprusside và thay đổi quy trình tạo màu. Màu đã xuất hiện nhanh rõ rệt so với các phương pháp truyền thống dùng indothymol xanh và indophenol xanh. Khoảng nồng độ xác định bằng phương pháp trắc quang là 0,04-1,2 mg/l theo NH₄ – N. Độ hấp thụ cho 1 µg NH₄ – N là 0,0215 (độ hấp thụ phân tử mol = 1,51.10⁴) ở 690 nm. Phương pháp so màu bằng mắt không sử dụng dụng cụ được coi là phương pháp phù hợp cho hiện trường đã được phát triển dựa trên các điều kiện tối ưu đối với phương pháp trắc quang đã xây dựng. Phương pháp đo bằng mắt này đã được áp dụng thành công để xác định nitơ-amoni trong các môi trường nước, mà không cần thiết bị cũng có thể phân tích được nhiều mẫu nước trong một thời gian ngắn trực tiếp ở vị trí lấy mẫu [26].

Sau đó các tác giả này [27] còn nghiên cứu một phương pháp làm giàu sơ bộ ngay tại chỗ đơn giản và nhanh chóng dùng cho việc xác định lượng NH₄⁺ nhỏ trong các mẫu nước bằng phổ quang kế đã được phát triển dựa trên phương pháp chiết pha rắn sử dụng một ống nhỏ có bọc ngoài một lớp octadecyl và bôi thêm lớp gel axit silisic (Sep-Pak C18 cartridge). Mẫu nước được đổ vào từ từ để công việc được tiến hành một cách đơn giản, và ngăn chặn được sự ô nhiễm ngay lập tức sau khi đổ các mẫu nước vào. Amoni trong mẫu nước được phản ứng với hypoclorit và thymol để chuyển thành màu xanh indothymol; sau đó màu xanh này sẽ được thu lại như một cặp ion gồm ion màu xanh indothymol và ion tetrabutylammonium trong ống Sep-Pak C18. Màu xanh indothymol trên ống duy trì được trong 4 ngày. Màu xanh này dễ dàng được tách rửa bằng một hỗn hợp gồm methanol và dung dịch sodium hydroxide 0,01mol/L. Độ đậm của màu được đo bằng quang phổ kế ở bước sóng 725nm. Phương pháp đề xuất này đã được ứng dụng thành công đối với các mẫu nước ngoài môi trường như nước sông và đã sử dụng vào việc đo amoni trong các mẫu nước sông Hii và sông Asakumi. Sông Hii chảy qua các khu vực không có dân cư và đổ vào hồ Shinji, và sông Asakumi là một con sông nội thành, chảy qua thành phố Matsue đổ vào hồ Nakaumi.

Keiichi Fukushi và cộng sự [19] đã sử dụng phương pháp điện di mao quản có đầu dò UV trực tiếp để xác định amoni trong các mẫu nước sông và biển. Theo cách này, các ion kim loại kiềm và kiềm thổ cùng có mặt trong mẫu không ảnh hưởng đến phép xác định. Giới hạn phát hiện (LOD) là 0,24 mg (N₂)/L. Kết quả phù hợp với việc phân tích bằng sắc ký ion.

Năm 2008, Abbas Afkhami và Rasoul Norooz-Asl [14] dã công bố một quy trình chiết điểm sương nhanh, chọn lọc và nhạy sử dụng hỗn hợp chất hoạt động bề mặt trung tính (Triton X-114) và cationic (cetyltrimethylammonium bromide – CTAB) để chiết indophenol đã thành thành trong phản ứng Berthelot với amoni từ dung dịch lỏng. Phản ứng dựa trên phản ứng màu của amoni và phenol dưới các điều kiện oxy hóa phù hợp trong môi trường kiềm và chiết điểm sương thuốc màu đã được sinh ra. Hiệu quả của phản ứng và các thông số chiết đã được nghiên cứu và các thông số tối ưu đã được xây dựng. Độ tuyến tính của phép xác định năm trong khoảng 2,00 ÷ 125,00 mg/L amoni. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 mg/L. Ảnh hưởng của một số ion cũng được kiểm tra. Phương pháp được ứng dụng để xác định amoni trong các mẫu nước tự nhiên.

Tóm lại, có rất nhiều nghiên cứu nhằm tìm kiếm xác định nhanh, tiện lợi, đơn giản và chính xác các kỹ thuật hiện đại trên cơ sở của sự tạo phức màu. Một số kỹ thuật phân tích được tổng kết trong bảng dưới đây.

Hiện trạng các nguồn nước sinh hoạt trong địa bàn Hà Nội bị nhiễm amoni là một vấn đề đang được quan tâm. Để có cái nhìn đúng đắn và khoa học về vấn đề này chúng ta cần nắm rõ được hiện trạng nhiễm amoni thực tế đang diễn ra. Vì thế để có được kết quả nhanh và chính xác thì phương pháp xác định là điều rất quan trọng. Nghiên cứu phương pháp xác định nhanh ion amoni không chỉ giúp đánh giá chính xác sự nhiễm amoni mà còn giúp tiết kiệm được thời gian cũng như công sức của đội ngũ kỹ thuật viên cũng như các nhà nghiên cứu, cho kết quả chính xác trong thời gian sớm nhất phục vụ tốt cho quá trình khảo sát, điều tra về tình trạng nhiễm amoni. Vì thế đối tượng nghiên cứu trong luận văn này là tìm ra phương pháp xác định nhanh amoni trong nước sinh hoạt và ứng dụng để đánh giá sự nhiễm amoni trong một số nguồn nước cấp của Hà nội.

Các tài liệu, số liệu, bản đồ, các công trình nghiên cứu có liên quan đến khu vực nghiên cứu sẽ được thu thập. Tài liệu thu thập được sẽ được xử lý, phân loại và từ đó xác định những vấn đề cần thiết cho việc nghiên cứu và khảo sát của luận văn.

Các phương pháp có thể sử dụng hoặc chuyển đổi để phân tích nhanh amoni được khảo cứu từ các tài liệu trong và ngoài nước. Các tài liệu, số liệu về nhiễm amoni trong các nguồn nước sinh hoạt của khu vực nghiên cứu, được thu thập từ Sở tài nguyên và môi trường, các báo cáo thường niên của địa phương và các nghiên cứu khoa học liên quan.
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm

Để đạt mục tiêu của luận văn, các phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã được tiến hành nhằm tìm chọn được phương pháp có thể xác định nhanh nồng độ amoni trong các mẫu nước cấp, nước ngầm và nước ăn uống.

Trên cơ sở tổng quan tài liệu, xem xét các phương pháp xác định amoni, hai nhóm thuốc thử vô cơ và hữu cơ được lựa chọn để khảo sát trong luận văn. Nhóm thuốc thử vô cơ được chọn là phương pháp sử dụng thuốc thử Nessler (phương pháp Nessler). Nhóm thuốc thử hữu cơ được lựa chọn là phương pháp Berthelot với thuốc thử dẫn xuất của phenol là thymol. Cả hai phương pháp này đều có thể chuyển hóa thành các phương pháp phân tích nhanh tại hiện trường (bằng cách xây dựng thang màu chuẩn - tương đương như đường chuẩn trên máy) thay vì đo trên máy trắc quang tại phòng thí nghiệm.

2.2.3. Phương pháp điều tra, khảo sát thực địa

Sau khi xây dựng được quy trình phân tích nhanh amoni, việc khảo sát thực địa được tiến hành nhằm mục đích lập sơ đồ lấy mẫu và lấy mẫu nước để đánh giá hiện trạng nhiễm amoni trong một số nguồn nước cấp khu vực nội thành Hà nội bằng quy trình phân tích đã xây dựng.

- Máy cất nước Aquatron A4000D, xuất xứ Cộng hoà Liên bang Đức.

- Cân phân tích hiệu Citizen, model: CX220, xuất xứ Ba Lan.

- Bình định mức các cỡ.

- Pipet có các dung tích khác nhau.

- Cốc thuỷ tinh, phễu, giấy lọc.

- Chai polietylen 500 ml.

- Tủ lạnh để bảo quản hoá chất và mẫu.

- Máy đo pH: Mi 151 Martini instruments, xuất xứ Phần Lan.

- Máy đo quang JASCO V-530, xuất xứ Nhật Bản.

Nước cất không amoni có thể chuẩn bị bằng cách: cho nước đã cất qua cột trao đổi ion chứa nhựa trao đổi ion hỗn hợp Amberlite MB-1. Hoặc có thể sử dụng thẳng nước cất 2 lần vừa mới sản xuất.

Sau đó, nước đã loại amoni được dự trữ trong bình thủy tinh trung tính có nút đậy kín khí. Sử dụng nước cất không amoni cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.

- Dung dịch amoni (N-NH₄⁺) chuẩn

+ Dung dịch gốc chứa 0,1 g N-NH₄/L: cân 0,3819 g NH₄Cl tinh khiết hoá học (đã sấy khô ở 105^oC trong 2h) cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất không amoni đến vạch mức. Dung dịch này có nồng độ N-NH₄⁺ = 1g/L.

+ Các dung dịch chuẩn có nồng độ amoni thấp hơn được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc trước khi sử dụng bằng nước cất không amoni.

- Dung dịch Segnet 30%: cân 50 g KNaC₆H₄O₆ hoà tan sau đó định mức tới 100 ml bằng nước cất không amoni.

- Thuốc thử Nessler

+ Nessler A: hòa tan một lượng cân chính xác 7,0 g KI và 10,0 g HgI₂ trong khoảng 50 ml nước cất không amoni, rồi định mức thành 100 ml.

+ Nessler B: cân chính xác 16g NaOH sau đó hoà tan và định mức thành 50 ml bằng nước cất không amoni.

Thuốc thử Nessler gồm 100ml Nessler A với 50ml Nessler B; trộn hai thể tích với nhau, lắc đều, để lắng một ngày trong chỗ tối, sau đó lọc lấy phần nước trong bằng giấy lọc hoặc gạn lấy dung dịch khỏi phần cặn lắng. Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu nâu có nút nhám và nên để trong bóng tối.

- Dung dịch Thymol 3%: cân chính xác 3,000 g thymol (5-metyl-2-isopropylphenol), hoà tan trong 100 ml dung dịch NaOH 2M.

- Dung dịch đệm: cân 0,794 g Na₂CO₃ và 0,504 g NaHCO₃ cho vào bình định mức 100 ml và định mức đến vạch bằng nước cất không amoni.

- Dung dịch chuẩn hypoclorit 1%: sử dụng 1 ml dung dịch hypoclorit (5% clo hoạt động , Pakshoo), pha loãng với 4 ml nước cất không amoni để được dung dịch chuẩn gốc. Dung dịch này có thể sử dụng trong 5 ngày.

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha các dung dịch có nồng độ mong muốn ngay trước lúc sử dụng.

- Dung dịch citrat kiềm: hòa tan 200 g Na₃C₆H₅O₇.2H₂O và 10 g NaOH trong nước không có amoni, lắc đều cho tan, sau đó định mức thành 1000 ml.

- Dung dịch oxi hóa: trộn lẫn 100 ml dung dịch citrat kiềm với 25 ml dung dịch hypoclorit.

- Dung dịch natri nitropruxit 2%: cân 2 g natri nitroprusside dihydrat (Na₄[Fe(CN)₅NO].2H₂O), hòa tan trong bình định mức 100 ml bằng nước cất không amoni. Bảo quản trong chai tối màu. Sau đó, pha các dung dịch làm việc có nồng độ mong muốn từ dung dịch này trước khi sử dụng.

Một số các hóa chất khác dùng cho nghiên cứu đều phải có độ tinh khiết PA hoặc tinh khiết hóa học của Việt nam, Trung quốc, Merck, Pakshoo. Các thuốc thử đều của hãng Merck.

2.3.2. Nghiên cứu xác định nhanh amoni trong nước sử dụng phương pháp Nessler

Đây là phương pháp đại diện và tiêu biểu nhất của thuốc thử vô cơ cho xác định amoni và có lẽ cũng là phương pháp đo màu sớm nhất được Julius Nessler (Nhà Hóa học người Đức, 1827-1905) đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1856. Nguyên tắc của phương pháp là dung dịch muối amoni loãng sẽ phản ứng với thuốc thử Nessler (K₂HgI₄) trong môi trường kiềm để sản sinh ra một chất keo màu vàng đến nâu sẫm/đỏ; để lâu hoặc nồng độ amoni lớn sẽ tạo kết tủa bông. Màu tạo ra giữa thuốc thử Nessler và ion amoni có cực đại hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 420 đến 500 nm tùy thuộc vào nồng độ amoni trong mẫu [APHA 18^th ed.].

Cũng phải nói rằng, phương pháp so màu với thuốc thử Nessler vốn là một phương pháp tiêu chuẩn và được coi là phương pháp đo chất lượng nước kinh điển hơn một thế kỷ qua [APHA 19^th & 20^th ed.]. Mặc dù việc sử dụng thủy ngân là độc và ngày nay đã không coi nó là phương pháp tiêu chuẩn nữa, nhưng nó vẫn được sử dụng để xác định amoni trong thực tế và cả để làm các test kit xác định nhanh amoni [24].

Các ion sắt, canxi, magie,... trong nước gây cản trở phản ứng nên cần phải loại bỏ bằng cách chưng cất hoặc che bằng dung dịch Segnet hay dung dịch EDTA. Nước đục xử lý bằng dung dịch ZnSO₄ 5%. Clo dư trong nước được loại trừ bằng dung dịch Natrithiosunfat 5%. Phương pháp Nessler có khả năng xác định được amoni trong khoảng 0,2 – 10,0 mg N-NH₃/L.

Đường chuẩn cho xác định ion amoni được xây dựng như sau: chuẩn bị 1 loạt ống Nessler (hoặc bình định mức) 50 ml thêm lần lượt 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7,0; 8,0; 9,0 và 10,0 ml dung dịch NH₄Cl tiêu chuẩn (nồng độ 50 mg NH₃/L). Thêm 1 ml dung dịch Segnet, lắc đều; thêm tiếp 2 ml dung dịch thuốc thử Nessler vào mỗi ống và điền nước đến 50 ml, lắc đều. Để yên 10 phút rồi so màu trên máy trắc quang ở bước sóng 420 nm.

Tiến hành xác định amoni trong các mẫu thực tế như sau: cho vào bình nón (dung tích 250 ml) 100 ml dung dịch mẫu nghiên cứu, thêm 1 ml ZnSO₄ 10%, lắc đều. Điều chỉnh pH đến 10,5 bằng dung dịch NaOH 6N. Để lắng vài phút rồi lọc lấy phần dung dịch. Tiếp đó lấy vào bình định mức 50 ml một lượng dung dịch đã lọc có hàm lượng NH₄⁺ trong khoảng từ 0,02 - 5,00 mg NH₃ - N/L (nếu hàm lượng cao hơn thì có thể pha loãng để có dung dịch nồng độ phù hợp). Loại bỏ các ion cản trở bằng cách thêm 1 ml dung dịch EDTA vào và khuấy đều dung dịch hay dùng 1 ml dung dịch Segnet để che các ion ảnh hưởng đến phép phân tích và thuốc thử Nessler. Thêm 2 ml dung dịch thuốc thử Nessler vào mẫu, lắc đều. Để yên 10 phút rồi so màu ở bước sóng 400-425 nm (nếu dùng cuvet có bề dày 1cm thì có thể phân tích được amoni theo nitơ đến 0,4-5,0 mg/L). Nếu nồng độ nitơ amoni đến 10 mg/L có thể xác định bằng phương pháp này đo ở bước sóng 525 nm.

Do màu của dung dịch dịch chuyển từ vàng sang nâu đỏ; cho nên phương pháp Nessler được khuyến cáo sử dụng hai vùng bước sóng để đo độ hấp thụ quang để nâng cao độ chính xác (400 - 425 nm cho khoảng nồng độ 0,2 - 5 mg/L và 450 - 500 nm cho khoảng nồng độ 5 - 10 mg/L) [15].

Để thích ứng với việc đo nhanh tại hiện trường, với các mẫu phân tích là nước cấp, chúng tôi đã tiến hành lập đường chuẩn và phân tích theo quy trình thu nhỏ như sau: chuẩn bị dãy các ống nghiệm dung tích 20 ml, đánh số thứ tự các ống nghiệm từ 1÷11. Cho vào từng ống nghiệm các dung dịch thuốc thử theo thứ tự như sau:

• 
  Dung dịch NH₄⁺ có nồng độ 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 mg/L được lấy lần lượt vào các ống nghiệm với thể tích như nhau là 10 ml.
  
• 
  Dung dịch Segnet 10%: 0,1 ml (tương đương 2 giọt), lắc đều.
  
• 
  Thuốc thử Nessler: 0,2 ml (tương đương 4 giọt), lắc đều.
  

Đối với mẫu phân tích, lượng mẫu được lấy để đo là 10 ml như đối với mẫu chuẩn và các bước tiến hành được làm tương tự như đối với mẫu chuẩn. Kết quả được xác định như sau:

Sau khi đo độ hấp thụ quang trên máy so màu ta được giá trị Abs. Sử dụng phần mềm chuyên dụng để rút ra phương trình đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ amoni trong mẫu.

Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b

→ x = ( y – b)/a

Các yếu tố ảnh hưởng là pH, nồng độ thuốc thử, các ion ảnh hưởng đến phản ứng và màu của dung dịch được khảo sát theo phương pháp thay đổi một thành phần với nồng độ amoni là 5 mg/L.

2.3.3. Xác định nhanh amoni trong nước sử dụng phương pháp Phenat

* Cơ sở lý thuyết và cơ chế phản ứng màu indophenol

Phương pháp Phenat là phương pháp dựa vào phản ứng tạo phức màu xanh đậm – indophenol giữa amoni và phenol với hypoclorit ở pH cao. Nhờ độ nhạy, độ chọn lọc cao và ít bị ảnh hưởng bởi các các ion khác, mà phương pháp phenat trong thực tế đã trở thành cơ sở vững chắc cho một quy trình phát hiện và phân tích ion amoni. Các lĩnh vực ứng dụng để phân tích amoni rất đa dạng gồm: xác định amoni trong nước, trong thực phẩm, dịch chiết từ đất, các vật liệu sinh học...[24].

Quá trình hình thành màu xanh của hợp chất indophenol đã được Berthelot mô tả từ đầu năm 1859 [23]. Sau đó, nhiều quy trình xác định amoni trên cơ sở phản ứng Berthelot ra đời và được ứng dụng vào thực tế. Hầu hết các bước tiến hành trong những quy trình khác nhau này đều gồm: việc đầu tiên là thêm một lượng chính xác dung dịch thuốc thử (phenol hoặc dẫn xuất của phenol) vào mẫu chứa amoni, tiếp theo thêm xúc tác (mangan sulfat hoặc natri nitroprusside) và sau đó là dung dịch chất oxy hóa. Nhiệt độ trong quá trình thực hiện các phản ứng tạo màu ở khoảng từ 27 – 37^oC; thời gian để màu hình thành và ổn định thường khoảng từ 20 đến 120 phút (tùy quy trình). Màu được hình thành có độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng từ 630 đến 690 nm (tùy thuộc vào dùng phenol hoặc một dẫn xuất nào đó của phenol và điều kiện phản ứng) [17, 20, 21, 22].

Sự có mặt của natri nitroprusside có tác dụng xúc tiến cho phản ứng nhanh hơn, đồng thời nó còn tham gia phản ứng với p-aminophenol tạo sản phẩm có màu tương tự hợp chất indophenol. Phản ứng xảy ra theo hai hướng như vậy đã làm tăng cường độ màu và độ nhạy của phương pháp.

Một điều lý thú khi nghiên cứu về sự hình thành màu xanh indo- là việc phát hiện ra khả năng làm tăng độ nhạy và tốc độ hình thành hợp chất màu của các thuốc thử chứa gốc phenol. Theo nhiều nghiên cứu [20], phân tử thuốc thử cần có một chỗ trống ở vị trí para, nhóm hydroxy ở vị trí 2- hoặc 3- so với nhóm ankyl và nhóm ankyl chứa từ 1-6 nguyên tử cacbon. Trên cơ sở đó, một loạt dẫn xuất phenol được thử nghiệm chi tiết và được kiểm tra bằng kỹ thuật ưu tiên để xác định tính phù hợp của chúng trong việc phát hiện, định lượng ion amoni. Chẳng hạn như 2-metylphenol; 2,6-dimetylphenol; 2-clophenol; 2,6- dicl ophenol; guaiacol; o-phenylphenol; m-cresol; 1-naphtol và đặc biệt là 2-metyl-5-hydroxyquinolin cũng được phát hiện là có thể sử dụng được trong thực tế (Analyst 109, 549 (1984)). Các thuốc thử thường được sử dụng nhiều nhất là phenol, axit salicylic và thymol [24].

Tùy thuộc vào nguồn hypochlorit và các hợp phần của phenol, một loạt các yêu cầu về điều kiện tối ưu cho các phản ứng đặc trưng phải được nghiên cứu như pH, thời gian, trình tự thêm tác nhân, ...

Theo phương pháp Phenat chuẩn, đường chuẩn và quy trình phân tích được tiến hành như sau: cho vào 25 ml mẫu (mẫu chuẩn hoặc mẫu phân tích) lần lượt 1 ml dung dịch phenol, 1 ml dung dịch nitroprusit và 2,5 ml dung dịch oxi hóa. Lắc đều sau mỗi lần cho thuốc thử vào mẫu. Đậy nắp bình lại và quấn ủ bình bằng giấy plastic hoặc parafin. Để bình trong buồng có nhiệt độ từ 22-27⁰ C với ánh sáng dịu và so màu ít nhất sau 60 phút ở bước sóng 640 nm. Đường chuẩn được tiến hành tương tự. Khoảng tuyến tính để phân tích amoni cả trong nước ngọt và nước biển đến 0,6 mg N-NH₃/L [APHA 19&20^th, Lucia Solórzano].

Các ion kim loại kiềm thổ và một số các ion kim loại hóa trị ba gây ảnh hưởng mạnh đến phản ứng này. Vì vậy, đa phần các mẫu nước tự nhiên có độ nhiễm bẩn mạnh và nước biển đều phải chưng cất thu amoniac và hấp thụ vào dung dịch axit sulfuric hoặc phải che các ảnh hưởng, rồi mới thực hiện được phân tích trắc quang.

Theo quy trình này, thời gian hình thành màu rất lâu và quy trình phân tích rất phức tạp nếu có các yếu tố ảnh hưởng. Với mục đích tìm chọn một quy trình xác định nhanh amoni trong các nguồn nước sinh hoạt, trong luận văn này, chúng tôi chọn thuốc thử Thymol – một dẫn xuất của phenol và hội tụ các điều kiện để đẩy nhanh tốc độ phản ứng nhằm có thể xác định nhanh amoni trong nước.

Nguyên tắc của phương pháp như đã trình bày ở phần trên. Màu xanh của hợp chất indothymol hình thành thông qua 2 bước để tạo ra các sản phẩm trung gian và sản phẩm mang màu. Tốc độ của phản ứng tổng thể phụ thuộc vào tốc độ phản ứng của mỗi bước. Việc nghiên cứu để tăng tốc độ phản ứng nhằm rút ngắn thời gian phân tích sẽ được nghiên cứu và khảo sát. Bên cạnh đó với sự tham gia của các thành phần phản ứng phức tạp, mỗi thành phần cũng sẽ được khảo sát. pH cũng là một yếu tố quyết định tính chọn lọc, độ chính xác của phương pháp do đó việc khảo sát pH của dung dịch, các thành phần đệm đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nghiên cứu này. Việc xác định amoni bằng phương pháp Phenat còn chịu ảnh hưởng của một số ion cản trở. Do đó nghiên cứu để loại bỏ các yếu tố này là một đòi hỏi mang tính thực tiễn cần khảo sát.

Đồng thời, khi tìm hiểu tài liệu chúng tôi nhận thấy, đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ cơ chế của phản ứng [14, 16, 17, 19, 20]. Các nghiên cứu đều cho thấy, thực chất của quá trình hình thành màu xanh indophenol trải qua hai giai đoạn:

- Giai đoạn thứ nhất: trong môi trường kiềm (ở pH khoảng 10), dung dịch chứa amoni tương tác với hypoclorit tạo thành monochloramin theo phương trình:

NH₄⁺ + OCl^- → NH₂Cl + H₂O (1)

- Giai đoạn thứ hai: monochloramin phản ứng với phenol để hình thành n-aminophenol ở pH khoảng 12 ÷ 13, với sự có mặt của chất xúc tác:

[Fe(CN)₅NO]^2-

C₆H₅O^- + NH₂Cl + OH^- -----------> OC₆H₄NCl + H₂O (2)

Sản phẩm của phản ứng (2) tiếp tục kết hợp với phân tử phenol thứ 2, tạo thành 4,4’-dihydroxyldiphenylamin và sau đó là phản ứng tạo thành hợp chất màu indophenol như sau:

OC₆H₄NH + C₆H₅O^- ------------------> OC₆H₄=N-C₆H₄O^- (3)

OC₆H₄=N-C₆H₄O^- <----------------> OC₆H₄-N-C₆H₄OH + Cl^- (4)

Màu xanh indophenol

Đối với thuốc thử là thymol, ở giai đoạn 2 monochloramin sẽ phản ứng với thymol để hình thành màu xanh của một cặp ion gồm ion màu xanh indothymol và ion tetrabutylamoni theo các phản ứng:

[Fe(CN)₅NO]^2-

CH_3­C₆H₃CH(CH₃)₂OH + NH₂Cl + OH^- ----> O=C₆H₂CH(CH₃)₂=N-Cl + H₂O

O=C₆H₂CH(CH₃)₂=N-Cl + CH₃C₆H₃CH(CH₃)₂OH <---------------->

O=C₆H₃CH(CH₃)₂=N-CH₃C₆H₃CH(CH₃)₂OH (Xanh)

Chính vì vậy mà nếu cho phản ứng tạo monocloramin xảy ra trước ở pH 10 sau đó cho tiếp phản ứng tạo màu indophenol ở pH 12 - 13 thì tốc độ của phản ứng tạo màu hoàn toàn sẽ rất nhanh. Do đó quy trình phân tích nhanh amoni tổng quát sẽ được thực hiện như sau:

Lấy 20 ml mẫu chuẩn hay mẫu phân tích cho vào bình định mức dung tích 25 ml. Thêm dung dịch natri nitropruxit, thêm tiếp dung dịch đệm (sử dụng đệm để dung dịch có pH xung quanh 10), sau đó thêm chất oxy hóa và lắc đều sau mỗi lần thêm rồi để yên 1 phút. Tiếp theo, thêm dung dịch thymol, lắc đều, để yên 3 phút và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 693 nm.

Cách xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị dãy các bình định mức dung tích 25 ml và đánh số thứ tự các bình từ 1÷ 9, cho vào từng bình các dung dịch thuốc thử (lắc đều bình sau mỗi lần cho), thứ tự như sau:

• 
  Lấy một thể tích 20 ml dung dịch NH₄⁺ chuẩn lần lượt có nồng độ 0,00; 0,02; 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,00 mg/L vào bình định mức 25 ml.
  
• 
  Dung dịch nitroprusside 0,2%: 0,5 ml.
  
• 
  Dung dịch đệm 1 ml để pH đạt khoảng 10.
  
• 
  Dung dịch oxi hóa: 1 ml dung dịch hypoclorit 0,1 %, lắc đều, sau đó để yên trong vòng 1 phút.
  
• 
  Thêm 1 ml dung dịch Thymol 1,5% và điền nước cất không amoni đến vạch mức. Lắc đều, để yên 3 phút, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 693 nm bằng máy đo quang JASCO V-530. Đường chuẩn được xây dựng trên kết quả thống kê của ít nhất 3 lần phân tích.
  

Các mẫu phân tích được tiến hành với thể tích mẫu là 10 ml (như đối với mẫu chuẩn). Trình tự các bước phân tích được tiến hành như đối với mẫu chuẩn. Kết quả được tính theo hai cách là đo trên máy và so sánh trên thang màu chuẩn để so sánh và đánh giá.

- Kết quả đo trên máy được làm như sau: Sau khi đo độ hấp thụ quang trên máy đo màu ta được giá trị Abs. Sử dụng phần mềm chuyên dụng để rút ra phương trình đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ amoni trong mẫu.

Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b

→ x = ( y – b)/a

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích nhanh amoni theo phương pháp Nessler