ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
- Điều hướng trang này:
- - Giai đoạn kết thúc kéo dài
- - Giai đoạn bảo quản
| - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các ADN polymerase sử
dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C , và nhiệt độ 72°C thường được sử dụng với enzyme này. Tại giai đoạn này ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với ADN khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5′ – phosphate của dNTP với nhóm 3′ – hydroxyl phía cuối của sợi ADN vừa mới được hình thành. Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. Thông thường, các ADN polymerase có khả năng khuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút. Trong điều kiện tối ưu, tức là, nếu không có hạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lượng ADN được khuếch đại sau mỗi chu kì tuần theo hàm mũ. - Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt độ 70-74 °C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trong phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả ADN sợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn. - Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng. Bảng 1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước Nhiệt độ Thời gian Biến tính khởi đầu 95 o C 1 - 5 phút Số chu kỳ Biến tính 90 - 95 o C 15 - 60 giây Bắt cặp mồi 40 - 70 o C 15 - 60 giây Kéo dài 72 o C 1 phút/1 kb 9 Kéo dài kết thúc 72 o C (60 o C) 0 - 30 phút Như vậy, theo tính toán lý thuyết, chỉ một bản sao ban đầu qua 35 chu kỳ khuếch đại bằng PCR sẽ có 2 36 bản sao, tương đương 68 719 476 736 (7.10 10 ), có khối lượng thực tế khoảng 1 g. µ Hình 1: Sơ đồ minh họa các bản sao được hình thành qua các chu kỳ phản ứng PCR Trong kỹ thuật PCR, sự khuếch đại tối ưu sẽ đạt đượng trong điều kiện sợi khuôn được tinh sạch. Tuy nhiên, ngày nay người ta vẫn tiến hành PCR với dịch chiết thô. Lượng ADN mẫu cho một phản ứng thường đạt ngưỡng tối thiểu là 100ng. Mặt khác, primer là chìa khóa của sự thành công hay thất bại của phản ứng. Vì thế, tiêu chuẩn của primer cần được kiểm soát chặt chẽ trong bước thiết kế. Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm thực phẩm, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh, phát hiện pháp y, xác định huyết thống… tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|