ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
- Điều hướng trang này:
- Bảng 2.
- 2.4.2. Phương pháp enzyme học: Phương pháp Sanger
| 2.4. Đọc trình tự
Hiện nay có 3 phương pháp đọc trình tự phổ biến, bao gồm: 2.4.1. Phương pháp hóa học: Phương pháp Maxam-Gillbert Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Nguyên lí của phương pháp như sau: Trước hết các phân tử ADN được đánh dấu một đầu bằng P 32 hoặc S 35 . Sau đó, chúng được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân đoạn ADN tại nucleotide đó. Năm nhóm nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C. Bảng 2. Các hóa chất sử dụng để biến tính các nucleotide (Maxam-Gillbert) Hóa chất Nucleotide bị tác động Dimethyl sulfate pH = 8 G Piperidine formate pH = 2 A+G 10 Hydrazine A+T Hydrazine + 1,5 M NaCl C Nhiệt độ cao (90 o C), 1,2 M NaOH A>C Kết quả của các xử lí hóa học là sự hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng, năm phân đoạn trên được đm phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí của các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện nhờ đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi. 2.4.2. Phương pháp enzyme học: Phương pháp Sanger Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự mạch đơn cần xác định trình tự nhờ enzyme ADN polymerase. Nguyên lí của phương pháp là ngoài các nucleotide đã bị biến tính nhóm OH ở vị trí 3' bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành liên kết phosphodiester và dẫn đến hiện tượng dừng tổng hợp. Trình tự ADN cần xác định phải được tạo dòng trên vector mạch đơn (thường là phage M13). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng. Người ta lần lượt cho vào mỗi phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng thấp. Như vậy, với một ADN khuôn duy nhất với bốn ống phản ứng khách nhau, mỗi ống có bổ sung chỉ một loại ddNTP và với một mồi trên thì sau khi phản ứng, quá trình tổng hợp sẽ tạo ra các đoạn oligonucleotide được kết thúc bởi các dideoxynucleotide. Tiến hành điện di trên bốn giếng gel polycarylamid khác nhau và kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|