TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
tải về 257.06 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 1.4.2. Phân loại
- 1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
- 1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
- 1.4.5. DETECTOR DAD
- 1.4.6. DETECTOR MS
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)1.4.1. Khái niệmPhương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… 1.4.2. Phân loạiDựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography). Trong đó, sắc ký pha đảođược sử dụng nhiều hơn cả. 1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảoTrong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này. Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất. 
Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS 1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảoPha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất. Trong đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải. Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid hoặc tính base của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký. Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn. 1.4.5. DETECTOR DADTrung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tinh khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 – 0,050 mm. 
Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ thống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện được tích – 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện. Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng điện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ. 
a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). 1.4.6. DETECTOR MSPhương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API). Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: * Phun mù điện tử (ESI). * Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI). * Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI). Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.
c. Các loại đầu dò khối phổCó các loại tổng quát sau: * Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection) - Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp. - Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn cong nhờ từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao. * Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer) - Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter) - Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap) * Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass spectrometry) * Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS). Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourierđược sử dụng nhiều hơn cả Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 257.06 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|