Tiªu chuÈn ngµnh 10 tcn 416-2000

Tiªu chuÈn nµy ¸p dông cho viÖc b¶o qu¶n dµi h¹n vi sinh vËt dÞ d­ìng hiÕu khÝ vµ vi hiÕu khÝ sö dông trong n«ng nghiÖp (trõ vi sinh vËt trong lÜnh vùc thó y) d­íi d¹ng lµ tÕ bµo sinh d­ìng vµ bµo tö trong ®iÒu kiÖn v« trïng b»ng ph­¬ng ph¸p nit¬ láng.

2.1. Vi sinh vËt n«ng nghiÖp: lµ c¸c lo¹i vi sinh vËt kh¸c nhau thuéc vi khuÈn, x¹ khuÈn, vi khuÈn lam, nÊm men, nÊm mèc ®ang lµ ®èi t­îng ®­îc nghiªn cøu vµ sö dông trong n«ng nghiÖp, ®­îc Bé n«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng th«n cho phÐp.

2.2. B¶o qu¶n vi sinh vËt: lµ b¶o qu¶n c¸c mÉu gièng thuÇn khiÕt sau khi ®· chän läc, trong ®iÒu kiÖn phï hîp ®Ó b¶o ®¶m ®é sèng sãt cao vµ b¶o tån c¸c tÝnh tr¹ng ban ®Çu.

2.3. B¶o qu¶n dµi h¹n: lµ b¶o qu¶n c¸c mÉu gièng trong thêi gian trªn 2 n¨m.

2.4. §Æc tÝnh sinh häc: lµ kh¶ n¨ng cña vi sinh vËt th«ng qua ho¹t ®éng sèng cña chóng cã t¸c dông ®Õn qu¸ tr×nh sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña c©y trång, vËt nu«i, kiÓm so¸t sinh häc vµ sinh th¸i m«i tr­êng.

2.5. M«i tr­êng nu«i cÊy chän läc: lµ m«i tr­êng chØ phï hîp cho sù sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña mét loµi hay mét nhãm vi sinh vËt nµo ®ã.

2.6. M«i tr­êng chÈn ®o¸n ph©n biÖt (m«i tr­êng chØ thÞ): lµ m«i tr­êng cho phÐp ph©n biÖt nhanh chãng mét lo¹i vi sinh vËt nµy víi c¸c lo¹i vi sinh vËt kh¸c.

2.7. MÉu gièng: lµ gièng do t¸c gi¶ thu thËp, chän läc, lai t¹o hay lÊy tõ quÜ gen cã tÝnh di truyÒn æn ®Þnh.

2.8. Thêi gian cÊy chuyÓn: lµ kho¶ng thêi gian gi÷a 2 lÇn cÊy ®Ó duy tr× c¸c tÝnh tr¹ng cña vi sinh vËt.

2.9. §é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng: lµ tû lÖ phÇn tr¨m cña sè l­îng tÕ bµo sèng sãt trong c¸c mÉu gièng b¶o qu¶n so víi mÉu gièng gèc khi míi ®­îc nu«i cÊy vµ ph¸t triÓn æn ®Þnh.

2.10. Håi phôc gièng: lµ qu¸ tr×nh cÊy chuyÓn vi sinh vËt tõ mÉu b¶o qu¶n vµo m«i tr­êng dinh d­ìng thÝch hîp ®Ó vi sinh vËt kh«i phôc l¹i c¸c tÝnh tr¹ng ban ®Çu.

3. Néi dung:

3.1. Trang thiÕt bÞ:

• 
  Tñ sÊy (thiÕt bÞ tiÖt trïng kh«) vµ nåi hÊp ¸p lùc (thiÕt bÞ tiÖt trïng ­ít)
  
• 
  Tñ Êm
  
• 
  Tñ cÊy v« trïng
  
• 
  Tñ l¹nh s©u
  
• 
  B×nh ®Ó mÉu vi sinh vËt cã chøa nit¬ láng
  
• 
  B×nh tr÷ nit¬ láng
  
• 
  G¨ng tay (Poleyolefin)
  
• 
  èng nghiÖm polypropylen cã nót xo¸y, dung tÝch 2ml, chÞu nhiÖt ®é thÊp, khö trïng ®­îc hoÆc ampul thuû tinh trung tÝnh
  
• 
  C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g
  
• 
  Que cÊy
  
• 
  Que g¹t thñy tinh
  
• 
  èng nghiÖm thñy tinh
  
• 
  èng ®ong
  
• 
  B×nh tam gi¸c
  
• 
  §Üa petri (hép lång)
  
• 
  Pipet chia ®é, pipetman
  
• 
  §Ìn cån hoÆc ®Ìn gas
  

3.2.1. ChuÈn bÞ dông cô:

• 
  C¸c dông cô dïng trong x¸c ®Þnh vi sinh vËt ph¶i tiÖt trïng b»ng mét trong c¸c ph­¬ng ph¸p d­íi ®©y:
  

+ Trong nåi hÊp ¸p lùc 1atmotphe (121⁰C) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.

• 
  ChuÈn bÞ èng nghiÖm polypropylen (hoÆc ampul): ng©m trong dung dÞch HCl 2% trong 12 giê. Sau ®ã röa l¹i b»ng n­íc m¸y 3 - 4 lÇn vµ tr¸ng l¹i b»ng n­íc cÊt råi khö trïng trong nåi hÊp ¸p lùc 1atmotphe (121⁰C) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.
  

• 
  M«i tr­êng nu«i cÊy sinh khèi vµ kiÓm tra ®é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng lµ m«i tr­êng nu«i cÊy chän läc (môc 2.5).
  

• 
  C©n vµ hoµ tan c¸c thµnh phÇn m«i tr­êng trong n­íc cÊt theo thø tù ®· cho. Ph©n phèi m«i tr­êng vµo c¸c b×nh tam gi¸c. §Ëy nót b«ng, khö trïng ë ®iÒu kiÖn phï hîp cho tõng lo¹i m«i tr­êng.
  
• 
  M«i tr­êng b¶o vÖ: cã tû lÖ s÷a t¸ch b¬ 10% (w/v), hoÆc glyxerol 10% (v/v), hoÆc Dimetyl sunfoxide (DMSO) 5% (v/v). M«i tr­êng b¶o vÖ cÇn ®­îc tiÖt trïng b»ng ph­¬ng ph¸p Pasteur, hoÆc mµng läc vi khuÈn hoÆc ë 121⁰C trong 15 phót.
  

• 
  Mét mÉu gièng vËt liÖu cÇn gi÷ mét l­îng mÉu lÆp l¹i kh«ng Ýt h¬n ba lÇn.
  
• 
  Kh«ng ®­îc chän nh÷ng khuÈn l¹c riªng biÖt trong c¸c lÇn cÊy chuyÓn lµm gièng (tr¸nh ®ét biÕn sinh tr­ëng).
  
• 
  ViÖc lÊy mÉu ®­îc tiÕn hµnh sao cho mÉu kiÓm tra ph¶i lµ mÉu thuÇn. Ng­êi lÊy mÉu ph¶i ®­îc huÊn luyÖn vµ cã kinh nghiÖm trong viÖc lÊy mÉu.
  
• 
  Trong qu¸ tr×nh lÊy mÉu, vËn chuyÓn vµ xö lý mÉu ph¶i ®¶m b¶o tr¸nh sù t¹p nhiÔm tõ bªn ngoµi vµ ®¶m b¶o ®­îc tÝnh nguyªn tr¹ng ban ®Çu.
  

3.2.4.1. ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï tõ mÉu gièng nu«i cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng:

• 
  C¸c mÉu gièng ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng thÝch hîp. Sau khi tÕ bµo ph¸t triÓn tèt, æn ®Þnh (pha sinh tr­ëng), thu sinh khèi vi sinh vËt ®Ó tiÕn hµnh b¶o qu¶n.
  
• 
  Dïng pipet v« trïng hót 5ml m«i tr­êng dinh d­ìng (NB) chøa 10% (v/v) glycerol hoÆc 5% (v/v) DMSO hoÆc 10% (w/v) s÷a t¸ch b¬ vµo mçi èng th¹ch nghiªng.
  
• 
  Dïng pipet v« trïng hót 5ml m«i tr­êng dinh d­ìng (NB) chøa 10% (v/v) glycerol hoÆc 5% (v/v) DMSO hoÆc 10% (w/v) s÷a t¸ch b¬ vµo mçi èng th¹ch nghiªng.
  
• 
  Dïng dông cô v« trïng ®¸nh tan toµn bé sinh khèi trªn bÒ mÆt th¹ch nghiªng vµo m«i tr­êng, sau ®ã hót toµn bé dÞch huyÒn phï tÕ bµo, ®¶m b¶o mËt ®é tÕ bµo Ýt nhÊt lµ 10⁸ tÕ bµo/ml.
  
• 
  Dïng pipet v« trïng ph©n 1ml cña dÞch huyÒn phï tÕ bµo vµo èng nghiÖm polypropylen, vÆn chÆt nót. Cã thÓ sö dông ampul thuû tinh, g¾n ®Çu ampul b»ng ®Ìn khß. Kh«ng ®Ó r©y dÞch vi sinh lªn mÐp hoÆc thµnh èng nghiÖm polypropylen hoÆc ampul.
  
• 
  §Æt ampul trong tñ l¹nh 5⁰C trong 30 phót ®Ó ®¹t ®­îc sù æn ®Þnh gi÷a tÕ bµo vµ m«i tr­êng.
  

• 
  C¸c mÉu gièng ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng dÞch thÓ thÝch hîp. Sau khi tÕ bµo ph¸t triÓn tèt, æn ®Þnh, tiÕn hµnh b¶o qu¶n b»ng nit¬ láng.
  
• 
  Dïng pipet v« trïng bæ sung mét l­îng 20% (v/v) glycerol hoÆc 10% (v/v) DMSO hoÆc 20% s÷a t¸ch b¬ ®· khö trïng b»ng thÓ tÝch cña dÞch vi sinh vËt ®Ó ®¹t nång ®é glycerol cuèi cïng 10% (v/v) hoÆc DMSO 5% (v/v) hoÆc s÷a t¸ch b¬ 10% (w/v).
  
• 
  L¾c nhÑ ®Ó thu ®­îc dÞch huyÒn phï tÕ bµo ®ång ®Òu, ®¶m b¶o mËt ®é tÕ bµo Ýt nhÊt lµ 10⁸ tÕ bµo/ml. NÕu gièng vi sinh vËt mäc thµnh viªn nhá hay thµnh ®¸m lín, cã thÓ dïng m¸y nghiÒn m« nhá hoÆc cèi sø v« trïng ®Ó nghiÒn n¸t.
  
• 
  Dïng pipet v« trïng ph©n 1ml cña dÞch huyÒn phï tÕ bµo vµo èng nghiÖm polypropylen, vÆn chÆt nót. Cã thÓ sö dông ampul thuû tinh, g¾n ®Çu ampul b»ng ®Ìn khß. Kh«ng ®Ó r©y dÞch vi sinh lªn mÐp hoÆc thµnh èng nghiÖm polypropylen hoÆc ampul.
  
• 
  §Æt ampul trong tñ l¹nh 5⁰C trong 30 phót ®Ó ®¹t ®­îc sù æn ®Þnh gi÷a tÕ bµo vµ m«i tr­êng.
  

• 
  §Æt èng nghiÖm polypropylen (ampul) vµo trong khay nh«m. Sau ®ã ®Æt vµo buång lµm l¹nh cña m¸y lµm l¹nh.
  
• 
  §iÒu chØnh tèc ®é lµm l¹nh 1-2⁰C/phót ®Õn khi nhiÖt ®é ®¹t ©m 30⁰C. Sau ®ã tiÕp tôc ®iÒu chØnh tèc ®é lµm l¹nh 1⁰C/phót ®Õn khi nhiÖt ®é ®¹t kh«ng nhá h¬n ©m 50⁰
  
• 
  Nhanh chãng chuyÓn èng nghiÖm polypropylen (ampul) ®Õn vÞ trÝ b¶o qu¶n cuèi cïng trong b×nh nit¬ láng (nhiÖt ®é tõ ©m156⁰C ®Õn ©m 196⁰C).
  

3.3. KiÓm tra gièng:

§Þnh kú hµng n¨m kiÓm tra ®é sèng sãt vµ ®Æc tÝnh sinh häc cña gièng. ChØ cho phÐp gi÷ l¹i c¸c gièng cã ®é sèng sãt vµ cã ho¹t tÝnh sinh häc æn ®Þnh nh­ gièng gèc.

3.3.1. KiÓm tra ®é sèng sãt cña gièng:

3.3.1.1. M«i tr­êng ®Ó kiÓm tra:

Dïng m«i tr­êng nu«i cÊy chän läc lµ m«i tr­êng ®Ó kiÓm tra. M«i tr­êng ®­îc pha chÕ theo thø tù c¸c ho¸ chÊt trong thµnh phÇn ®· cho. Sau ®ã ph©n phèi vµo c¸c dông cô thuû tinh ®· chuÈn bÞ tr­íc råi khö trïng ë nh÷ng ®iÒu kiÖn phï hîp. §Ó nguéi m«i tr­êng ®Õn 45-50⁰C råi ph©n phèi vµo c¸c ®Üa petri v« trïng. Thao t¸c nµy ®­îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn v« trïng.

3.3.1.2. DÞch pha lo·ng: N­íc muèi sinh lý (NaCl 0,85%), kh«ng chøa c¸c hîp chÊt nit¬, sau khi khö trïng cã ®é pH lµ 7,0.

Ph©n phèi dÞch pha lo·ng vµo c¸c èng nghiÖm cã dung tÝch thÝch hîp víi mét l­îng sao cho sau khi khö trïng, mçi èng nghiÖm chøa 9ml. Lµm nót b«ng vµ khö trïng ë 1 atmotphe (121⁰C) trong 30 phót.

NÕu ch­a sö dông ngay, dÞch pha lo·ng cÇn ®­îc b¶o qu¶n trong tñ l¹nh ë nhiÖt ®é 4-10⁰C, thêi gian b¶o qu¶n kh«ng qu¸ 1 th¸ng kÓ tõ ngµy chuÈn bÞ.

Ghi chó: §Ó tr¸nh lµm ¶nh h­ëng ®Õn c¸c vi sinh vËt do thay ®æi nhiÖt ®é ®ét ngét, nªn ®iÒu chØnh nhiÖt ®é cña dÞch pha lo·ng ®Õn nhiÖt ®é phßng thö nghiÖm tr­íc khi sö dông.

3.3.1.3. ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï tÕ bµo (suspension):

• 
  LÊy èng gièng b¶o qu¶n cÇn kiÓm tra ra khái b×nh nit¬ láng, cho b¨ng tan tù nhiªn (trong ®iÒu kiÖn phßng thö nghiÖm).
  
• 
  Lau bªn ngoµi cña èng nghiÖm polypropylen (ampul) b»ng g¹c v« trïng cã thÊm etanol 70% (v/v), ®Æc biÖt chó ý ®Õn vïng gi÷a nót vµ th©n èng.
  
• 
  Më nót èng nghiÖm polypropylen (ampul) trong ®iÒu kiÖn v« trïng. Dïng b¬m tiªm ®· v« trïng hót 1ml dÞch huyÒn phï trong èng nghiÖm cho vµo 9 ml dÞch pha lo·ng, tr¸nh ch¹m b¬m tiªm vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-10 gi©y. LÆp l¹i c¸c thao t¸c nµy ®Ó thu ®­îc dÞch pha lo·ng 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7.
  
• 
  CÊy mÉu: dïng pipet v« trïng lÊy tõ dÞch mÉu pha lo·ng mét l­îng 0,05 ml mÉu (1 giät) cÊy vµo 1 ®Üa petri chøa m«i tr­êng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.3.1). Mçi mÉu pha lo·ng ®­îc cÊy vµo 3 ®Üa petri (mçi ®é pha lo·ng sö dông 1 pipet v« trïng riªng).
  
• 
  Dïng que g¹t v« trïng g¹t ®Òu dÞch mÉu trªn bÒ mÆt th¹ch, ®îi kh« bÒ mÆt th¹ch, óp ng­îc ®Üa petri, ®Ó trong tñ Êm víi nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp.
  
• 
  §Õm sè l­îng khuÈn l¹c ®Æc tr­ng cña mÉu gièng vi sinh vËt trªn mçi ®Üa petri.
  
• 
  MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra (ml) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau:
  

Trong ®ã:

A: Sè khuÈn l¹c/ml dÞch;

a: Sè khuÈn l¹c trung b×nh cã trong ®Üa petri;

d: Nång ®é dÞch pha lo·ng;

20: Sè giät dÞch trong 1 ml dÞch.

3.3.2. X¸c ®Þnh ®Æc tÝnh sinh häc: