Kuhn Lederer Winterstein thực hiện điều chế Carotenoid trên cột
PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ
tải về 236.63 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.3.2.3Cấu trúc, đặc trưng của G-25
- 2.3.2.4Các tương tác không đặc hiệu
- 2.3.2.8Kiểm tra cột đã nhồi
- 2.3.2.9Chọn dung môi, mẫu
- 2.3.2.11Tái chế - Ghép hai cột cùng loại - Đệm lựa chọn và độ pH thường ít ảnh hưởng 2.3.2.12Rửa cột, Phục hồi
- 2.3.3.2Cấu trúc hóa học
- 2.3.3.6Dung môi, mẫu Để đảm bảo tuổi thọ của cột,dung môi và mẫu nên được lọc trước khi sử dụng. Thể tích mẫu nên từ 1-2% tổng thể tích của khối Sephadex. 2.3.3.7Khai triển cột
- 2.3.3.10Tinh chế sản phẩm
2.3PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬCác lọai pha tĩnh trong sắc ký rây phân tử:
Loại pha tĩnh thường được dùng trong sắc kí rây phân tử là Sephadex. Vì vậy trong bài này sẽ nói về cơ chế, tính chất, đặc điểm sử dụng và phạm vi ứng dụng của Sephadex. Công thức chung: 
Bản chất, cơ chế tách: Sephadex là 1 thương hiệu của hãng Pharmacia để chỉ các loại hạt xốp tổng hợp từ dextran bằng cách cho tác dụng với epichlohydrin glycerol trong môi trường kiềm. Các nhóm OH của dextran-polysaccharid sẽ tạo dây nối ether và hình thành mạng 3 chiều. Kích thước của phân tử dextran và nồng độ epichlohydrin glycerol và các điều kiện của phản ứng sẽ quyết định kích thước mắt lưới và khả năng tách của dextran-mạng. Nếu các nhóm OH được alkyl hóa thì sephadex trở nên kị nước hơn và bị trương lên trong một số dung môi phân cực. Hai loại Sephadex thông dụng nhất hiện nay trong việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên là SEPHADEX G-25 VÀ SEPHADEX LH-20
2.3.1Cơ chế tách:Mỗi hạt gel đều có những mắt lưới to hay nhỏ phụ thuộc vào loạị gel. Trong quá trình sắc ký, các chất phân tử lớn sẽ chỉ di chuyển ở pha lỏng phía ngoài hạt gel, và sẽ nhanh chóng rút ra khỏi cột. Trong khi đó, các chất có kích thước nhỏ hơn sẽ chui qua các mắt rây vào bên trong hạt gel với mức độ khác nhau tuỳ theo khối lượng và hình dạng của chúng, và sẽ ra khỏi cột gel chậm. Phân tử càng nhỏ càng phải len lách nhiều trong hạt gel, và càng ra chậm. Do vậy có thể coi việc tách các chất bằng gel Sephadex như một quá trình sàng lọc (rây) phân tử. Các phân tử được phân bố thụ động giữa thể tích kẽ (thể tích bên ngoài hạt gel- V0) và thể tích bên trong hạt gel (Vi), phụ thuộc vào khả năng chui được vào bên trong hạt gel của chúng. Nếu tổng thể tích của cột là Vt, thì: Vt = Vo + Vi 2.3.2Sephadex G-25Sephadex G là loại sephadex thân nước, kích thước của mắt lưới càng nhỏ thì khả năng hút nước để tạo thành gel ( khả năng trương nở ) của Sephadex càng nhỏ. Có nhiều cỡ Sephadex G như G-10, G-15, G-25, G-50, G-75, G-100, G-150, G-200 ( Sắp xếp theo độ mịn của mắt lưới giảm dần: G-10 là loại mịn nhất = hút nước ít nhất trong dãy này). Kích thước mắt lưới càng lớn càng thích hợp nghiên cứu những chất có phân tử lượng lớn. Loại sephadex G thường dùng trong ngành dược liệu là G-75. 2.3.2.1Đặc điểm chung
2.3.2.2Phạm vi ứng dụng
2.3.2.3Cấu trúc, đặc trưng của G-25Một số đặc điểm của Sephadex G25:
Thể tích gel tạo thành với Sephadex G-25 từ những dung môi khác nhau:
2.3.2.4Các tương tác không đặc hiệuTương tác ion Là do thực tế các phân tử dextran mạng 3 chiều chứa một vài nhóm carboxylic kết thúc; gel sẽ hoạt động như một bộ trao đổi cation yếu với công suất rất thấp. Nói chung, nồng độ ion 0,05 trong bộ đệm dung môi pha động là đủ để loại bỏ những hiệu ứng này.
2.3.2.5Loại tạpCác bước loại bỏ ô nhiễm kim loại nặng (ppb): - Rửa cột bằng HCl 0,1 M ở nhiệt độ phòng (điều này sẽ ảnh hưởng đến các gel một cách nào đó để sau khi số chu kỳ thay thế gel có thể là cần thiết) - Rửa cột bằng giải pháp tạo phức (0,1 M EDTA hay DES ferrioxamine(Ciba – Geigy) hay dihydroxy benzoic acid) - Rửa cột với bộ đệm dung dịch pha động 2.3.2.6Đặc điểm sử dụng- Làm trương nở gel khô - Thời gian trương nở: 24h ở 200C hoặc 3h ở 900C - Ngâm gel khô trong một thể tích dung môi (thường dùng nước) ngập mặt gel. Thể tích dung môi cần cho 1g gel khô khoảng 12-15ml (bed volume ≠12-15ml/g) - Tránh khuấy trộn mạnh vì có thể phá vỡ hạt và không dùng khuấy từ trong giai đoạn này. Có thể tăng tốc độ trương nở bằng cách dùng nước sôi, cách này cũng giúp đuổi khí. Gạn, lọc để loại những tiểu phân mịn. - Tạo hỗn dịch với 75% gel đã trương nở và 25% dung môi (nước).
2.3.2.7Nhồi cột- Nhiệt độ của hỗn dịch gel nên được đạt tới nhiệt độ hoạt động của cột trước khi bắt đầu nhồi cột. - Cột nên được nhồi với áp suất không gây ra sự biến dạng hạt: áp suất không nên vượt quá 16kPa( giá trị áp dụng cho cột 30x2,6cm, với đệm nước ở nhiệt độ phòng). Giá trị này phụ thuộc độ nhớt của dung môi sử dụng. 2.3.2.8Kiểm tra cột đã nhồi- Chạy không tải với Blue dextran 2mg/ml - Quan sát vùng mà chất này chạy qua, nếu cột được nhồi tốt sẽ nhìn thấy một băng riêng rẽ chạy qua cột. Nếu không, cột đã có vấn đề có thể do nguyên nhân như: bộ lọc bẩn, bề mặt không đồng đều hay nhồi cột không đồng đều. Trong trường hợp này, phải nhồi cột lại - Ổn định cột:
2.3.2.9Chọn dung môi, mẫuDung môi: - Thành phần dung môi không ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng rửa giải. - Những chất không mang điện, dung môi thường được dùng với Sephadex G75 là nước - Với những chất chứa nhóm mang điện tích, dung môi được thêm hệ đệm là Tri-HCl. Sodium phosphat để ổn định pH. Một ion mạnh được đề nghị sử dụng để bảo vệ mạng lưới gel khỏi tương tác ion. NaCl được dùng với mục đích này. - Với những sản phẩm đông khô, nên sử dụng các chất đệm dễ bay hơi như Amoni acetat, Amonium bicarbonat…
Thể tích mẫu nên ở trong khoảng 1-5% thể tích của khối gel. 2.3.2.10Tối ưu hóaCác thông số điều chỉnh: - Thể tích mẫu : Một thể tích mẫu nhỏ cho độ phân giải tốt hơn - Tốc độ dòng chảy : Tốc độ dòng chảy thấp hơn cho độ phân giải tốt hơn đối với các thành phần có trọng lượng phân tử cao. Ngược lại có thể đúng cho các thành phần có trọng lượng phân tử nhỏ khi chúng khuếch tán nhanh hơn. - Thời gian phân tách dài hơn, thể tích mẫu lớn hơn. - Chiều dài cột: Độ phân dải của hai khu vực phân tách tăng tỉ lệ với căn bậc hai của chiều dài cột. - Chiều cao cột : hiệu quả có thể được tăng lên bởi 2.3.2.11Tái chế- Ghép hai cột cùng loại - Đệm lựa chọn và độ pH thường ít ảnh hưởng 2.3.2.12Rửa cột, Phục hồiRửa cột bằng 2 thể tích cột dung dịch làm sạch không có ion. Rửa bên ngoài cột bằng ddNaOH 0,2M do sự trương nở. 2.3.3Sephadex LH20Sephadex LH được tạo thành do acyl hóa hoặc akyl hóa một số nhóm –OH của SephadexG. Do đó nó vừa có tính thân dầu, vừa có tính thân nước. Sephadex LH20 được akyl hóa từ Sephadex G25. Sephadex LH20 là một loại chất mang trong sắc kí được thiết kế để phân lập những hợp chất tự nhiên kém tan hoặc không tan trong nước như steroid, terpenoids, lipids và peptid có phân tử lượng thấp.
2.3.3.1Đặc điểm chung- Tính chất lưỡng cực vừa thân dầu vừa thân nước của phân tử. - Dễ dàng dự đoán hoạt động rửa giải dựa trên cấu trúc hóa học của mẫu . - Tính chất lý hóa ổn định, bền vững. - Đồng nhất giữa các lô sản xuất Sự đồng nhất giữa các lô được chứng minh trong bảng dữ liệu quản lý chất lượng Sephadex LH20:
2.3.3.2Cấu trúc hóa học:
Tính chất vật lý, hóa học Tính lưỡng cực: thân dầu do nhóm –OR, thân nước do nhóm –OH chưa phản ứng. Do đó LH20 trương nở trong nước và một số dung môi hữu cơ. Kích thước của hạt keo phụ thuộc vào dung môi sử dụng
Thể tích gel được tạo thành với Sephadex LH20 ở những dung môi khác nhau:
Lưu ý: dung môi cho thể tích gel nhỏ hơn 2.5ml/g gel khô thường không được sử dụng 2.3.3.3Đặc điểm sử dụng- Chuẩn bị hỗn dịch trung gian: làm trương nở gel khô. - Sephadex LH20 được cung cấp dưới dạng bột khô và phải làm trương nở trước khi sử dụng. - Trong quá trình làm trương nở, chú ý không khuấy mạnh vì có thể làm vỡ hạt, không dùng khuấy từ. - Làm trương nở hoàn toàn chất mang ít nhất 3h trong lượng dung môi ngập mặt ở nhiệt độ phòng. - Tạo hỗn dịch sệt với tỷ lệ 75% gel đã trương nở và 25% dung môi. Những tiểu phân mịn có thể loại ở giai đoạn này - Các dung môi thường dùng là MeOH, CHCl3, hỗn hợp MeOH và CHCl3 2.3.3.4Nhồi cột- Ổn định tất cả nguyên liệu, thiết bị ở nhiệt độ phòng - Khuấy đều hỗn dịch và rót vào cột đã có sẵn một lớp dung môi,mở khóa cột, dùng dung môi rửa sạch thành cột và gõ quanh thành cột đến khi mặt thoáng của cột trở nên phẳng và không còn bọt khí. Chú ý: Trong một số dung môi, ví dụ chloroform, Sephadex LH-20 nhẹ hơn dung môi và bị nổi trong dung môi. Trong trường hợp nây nên dùng hệ thống cột được trang bị thêm 2 adaptor(điều áp) như SR25/45 và SR25/100. 2.3.3.5Ổn định cột- Trước khi tiêm mẫu, nếu thay đổi dung môi khai triển so với lần sắc kí trước đó, chú ý tính trương nở khác nhau trong những dung môi khác nhau. Cần ổn định cột với dung môi khai triển mới bằng cách cho dung môi chạy không tải đến khi chiều cao cột gel không thay đổi nữa. - Không cần thiết phải ổn định cột nếu chạy cùng một hệ dung môi. 2.3.3.6Dung môi, mẫuĐể đảm bảo tuổi thọ của cột,dung môi và mẫu nên được lọc trước khi sử dụng. Thể tích mẫu nên từ 1-2% tổng thể tích của khối Sephadex. 2.3.3.7Khai triển cột- Tốc độ dòng chảy phụ thuộc ứng dụng,tốc độ 1-10cm/h được đề nghị. Thông thường,tốc độ chảy càng chậm càng tốt - Để thay đổi tốc độ dòng cho từng cỡ cột khác nhau, áp dụng công thức sau: Tốc độ dòng(cm/h) = Thể tích dòng chảy(cm3/h) / Diện tích cột(cm2) - Vì tính trương nở của sephadex LH20 phụ thuộc vào dung môi( bảng 3),do đó tất cả thể tích(dung môi, dung môi khai triển, cột…) được tính toán dựa vào thể tích của khối Sephadex. - Để thay đổi thể tích cột tăng hay giảm tương ứng với thể tích khối gel, có thể tính theo công thức sau: V mới = V cũ* V khối gel mới / V khối gel cũ 2.3.3.8Phục hồi cộtKhi chấm dứt quá trình sắc ký, Sephadex được rửa ngay trên cột đó với một lượng lớn dung môi ( thường dùng methanol) cho đến khi dung dịch rửa cột không còn vết của chất vừa sắc ký 2.3.3.9Phạm vi ứng dụng- Sắc ký rây phân tử có phạm vi ứng dụng khá rộng, nhất là trong các lĩnh vực nghiên cứu polymer, hóa sinh, vi sinh, sinh học phân tử. Trong hóa thực vật, chúng thường dùng để - Loại muối đường ra khỏi hỗn hợp mẫu nghiên cứu 2.3.3.10Tinh chế sản phẩm- Phân lập các cấu trúc hóa học có kích thước khác nhau - Sắc ký rây phân tử với Sephadex thường được dùng để tách 1 hỗn hợp đa thành phần thành những nhóm chất có cấu trúc, kích thước phân tử tương đương. Những nhóm chất này thường là một hỗn hợp, vì vậy muốn có được những chất tinh khiết, cần phải tiếp tục bằng những biện pháp khác. 2.4TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Phương pháp nghiên cứu dược liệu - Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh 9.2010. trang 63, 64. 2. Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm (2009), Giáo trình Hóa phân tích trang 207. 3. HPLC for pharmaceutical scientists - Yuri kazakevich and Rosario lobrutto-2007. Page 93-105. 4. Alltech Chromatography Sourcebook, 2004-04 cataloge. 5. McIntire, Roth and Shaw, J. Biol. Chem., 170 (1947). 6. R. Leboda, Carbon-mineral adsorbents — new type of sorbents? Part I. The methods of preparation- Faculty of Chemistry, Maria Curie-Skłodowska University, 20031 Lublin, Poland (1991) Phương pháp nghiên cứu dược liệu- đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh 9.2010. trang 63,64. HPLC for pharmaceutical scientists- Yuri kazakevich and Rosario lobrutto-2007. Page 93-105. Alltech Chromatography Sourcebook, 2004-04 catalog. GE Healthcare Life Sciences - Products - Sephadex G-10,G-15,G-50, and G-75 GE Healthcare Life Sciences - Products - Sephadex G-10,G-15,G-50, and G-75 Каталог: before2015 before2015 -> Nhớ Anh Yêu – Học cho tốt nhe! ÔN tập phân loại thực vật nè em nhóm các ngành quyết và thôNG tải về 236.63 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||