Kuhn Lederer Winterstein thực hiện điều chế Carotenoid trên cột
PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ PHÂN BỐ
tải về 236.63 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.2.2Cơ chế của sắc ký phân bố
- 2.2.3.1Cấu tạo, trạng thái
- 2.2.3.2Cơ chế hoạt động Chủ yếu là cơ chế phân bố: pha động là dung môi khai triển,pha tĩnh là nước nằm trong các xoang của giá cellulose. 2.2.3.3 Phạm vi ứng dụng
- - Độ tinh khiết cao của sợi cellulose MN 301 HR
- - Trải bột cellulose trong TLC
- 2.2.3.5-Diethylaminoethyl (DEAE) cellulose RO-C 2 H 4 -N(C 2 H 5 ) 2
- 2.2.4 Polyamide
- 2.2.4.1Cấu tạo, trạng thái
- 2.2.4.3Ưu điểm vượt trội của polyamide so với các chất khác
- 2.2.5.1Cấu tạo, trạng thái, biến đổi
- 2.2.5.2Cơ chế tách của pha tĩnh silicagel-ghép
- 2.2.5.3Đặc điểm sử dụng, ứng dụng
- 2.2.5.5Yếu tố ảnh hưởng chất lượng pha tĩnh
- 2.2.6Pha tĩnh diaion HP-20
- 2.2.6.2C ấu tạo, tính chất lý hoá
2.2PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ PHÂN BỐ2.2.1Khái niệm- Phân bố là một hiện tượng vậy lý theo đó chất tan (mẫu thử) được phân bố đồng thời vào 2 pha lỏng không tan trong nhau. Trong sắc ký phân bố 2 pha lỏng này là pha tĩnh và pha động. - Tỷ số nồng độ của các cấu tử tan A, B…trong pha tĩnh và pha động được gọi là các hệ số phân bố Ka, Kb Ka= [A] trong pha tĩnh / [A] trong pha động Kb = [B] trong pha tĩnh / [B] trong pha động - Hệ số K càng lớn thì mẫu càng tập trung trong pha tĩnh, di chuyển chậm, và ngược lại
2.2.2Cơ chế của sắc ký phân bố- Cơ chế phân bố còn gọi là cơ chế tách lỏng –lỏng - Pha lỏng thứ nhất là pha tĩnh được tẩm trên bề mặt hoặc được hút vào trong các xoang của một giá xốp ( như silicagel RP-18, giấy sắc ký, bột cellulose…) . Pha lỏng thứ hai là pha động ( không hỗn hòa với pha tĩnh) được cho chảy xuyên qua hệ thống “giá+ pha tĩnh”. - Nếu mẫu thử tan nhiều trong pha động hơn (K bé) thì nó sẽ bị pha động kéo đi nhanh hơn. Nếu mẫu thử tan nhiều trong pha tĩnh hơn (K lớn) thì nó sẽ bị giữ lại trong hệ thống “giá+ pha tĩnh” lâu hơn. - Sau khi được nạp vào hệ thống sắc ký, các cấu tử A, B có trong mẫu thử sẽ được phân bố đồng thời vào pha tĩnh (nằm trên giá) và pha động (là dung môi khai triển) theo các hệ số phân bố Ka, Kb khác nhau. Với Ka ≠ Kb, sau khi di chuyển qua rất nhiều đĩa lý thuyết, nồng độ của A, B tại tiếp tuyến càng lúc càng chênh lệch. Tới đĩa lý thuyết thứ N vừa đủ lớn thì sự chênh lệch này là quá lớn: hổn hợp tại đĩa thứ N lúc bấy giờ hầu như chỉ có duy nhấy 1 chất tinh khiết. Khi đó ta nói trên hệ thống đã hoàn tất quá trình sắc ký phân bố 2 chất A và B. 2.2.3Cellulose- Thường được dùng để tách những chất phân cực mà khó tách hoặc không thể tách được bằng cơ chế hấp phụ (polysaccarid, acid amin, acid carboxylic, acid nucleic, phosphat, một số polyphenol). - Sắc ký lớp mỏng trên cellulose có thể được xem như một phần mở rộng của giấy sắc ký cổ điển. Việc tách chủ yếu dựa trên cơ chế sắc ký phân bố, tuy nhiên, hiệu ứng hấp phụ có thể không được loại trừ. 2.2.3.1Cấu tạo, trạng thái- Là một polysaccharid ở dạng polymer (C6H10O5)n 
- Tự nhiên cellulose có dạng sợi, khi được tạo thành dạng vi tinh thể cellulose có hình que khá đồng dạng, có xoang rỗng rất lớn. 2.2.3.2Cơ chế hoạt độngChủ yếu là cơ chế phân bố: pha động là dung môi khai triển,pha tĩnh là nước nằm trong các xoang của giá cellulose. 2.2.3.3 Phạm vi ứng dụng- Sắc kí cột thường dùng cellulose dạng vi tinh thể: cellulose vi tinh thể được làm ẩm với một lượng pha tĩnh (thường là nước, methanol) vừa đủ, hòa bột cellulose ẩm vào một dung môi khác (pha động) tạo thành một hỗn dịch. Đổ hỗn dịch này vào cột, để lắng cột, nạp mẫu và khai triển với pha động. Thường dùng cột phân bố để tách các chất phân cực như đường, polysaccharid, polyphenol, acid amin... - Sắc kí phẳng thường dùng cellulose sợi dưới dạng giấy: giấy Whatman, giấy FN. - Cellulose cột sắc ký là một dạng thu nhỏ của sắc ký giấy, phù hợp với việc tách tất cả các loại flavonoid, đặc biệt glycoside từ khác hoặc từ aglycones và dùng để tách các aglycone kém phân cực. Nó được sử dụng cho phân ly dựa trên cả hai cơ chế hấp thụ và phân bố (phụ thuộc vào dung môi được sử dụng), mặc dù sự khác biệt giữa hai là thường khó khăn để thực hiện. Về nguyên tắc, hàng loạt các dung môi phát triển để sử dụng trong phân vùng sắc ký giấy có sẵn cho sắc ký cột và sắc ký phân bố đã được sử dụng thành công. Bột cellulose có năng lực thấp và hạn chế. Vì vậy, có đã được một xu hướng đáng chú ý ra khỏi cellulose là polyamid trong đó cung cấp tính linh hoạt tương đương, nhưng năng lực cao hơn. Các dung môi cho cellulose cột được của dung dịch nước rượu và các loại acid. - Một số ví dụ như sau:
Cellulose cột sắc ký đã không được đề xuất việc tách muối flavylium. 2.2.3.4Cải tiến- Sợi cellulose MN 301 là một cellulose chất lượng cao, sản xuất theo quy trình chuẩn của cellulose và đáp ứng các yêu cầu cần thiết cho TLC. Nhiệt độ trung bình polyme hoá (DP) bột cellulose MN 301 khoảng 400-500oC, dài khoảng 2 - 20 μm. - Khoảng 25% các hạt không hòa tan trong nước với bột cellulose , đồng nhất sau 30 đến 60 giây trong máy trộn - sản xuất lớp với tính đồng nhất tối ưu. Lớp Cellulose tốt nhất là khô trong không khí, không cần kích hoạt ở nhiệt độ cao và việc lưu trữ các lớp cellulose trong không khí làm tăng cường hiệu suất tách. Bột Cellulose MN 301 khác đáng kể so với sắc ký giấy bằng các sợi mịn, được bảo quản tốt và lâu hơn. Bột cellulose sợi ngắn ngăn ngừa gần như sự lan rộng ngay lập tức của các chất xảy ra dọc theo ranh giới của các sợi dài. Vì vậy chất tập trung nhỏ, gọn hơn trên giấy. - Độ tinh khiết cao của sợi cellulose MN 301 HR
- Trải bột cellulose trong TLC
Bảng so sánh các loại bột cellulose
Trong sắc ký lớp mỏng, bột cellulose trao đổi ion chủ yếu được sử dụng để tách các protein, amino axid, enzyme, acid nucleic, hormon và virus. Được sử dụng nhất cho các ứng dụng này là DEAE cellulose. Cellulose trao đổi ion có tính chất trao đổi ion như nhựa trao đổi, tuy nhiên, chúng khác nhau trong một số điểm quan trọng. Celluloses trao đổi ion được chế biến từ cellulose tự nhiên của các nhóm liên kết cơ bản thông qua cầu ête hay este. Cellulose trao đổi có diện tích bề mặt lớn, mà kết quả từ cấu trúc sợi, nguyên nhân một số lượng lớn các nhóm thế được gần với bề mặt. Đây là lý do tại sao các phân tử lớn ưa nước như các protein có thể dễ dàng xâm nhập. Khoảng cách của các nhóm hoạt động khoảng 50 Å cho cellulose trao đổi rất dài so với khoảng cách khoảng 10 Å cho các loại nhựa trao đổi. Kết quả là cellulose trao đổi có công suất lớn hơn so với nhựa trao đổi cho các phân tử lớn như protein. Ngoài ra, do khoảng cách dài hơn giữa các nhóm hoạt động, liên kết chỉ xảy ra tại một hoặc rất ít vị trí, cho phép một lựa chọn giải hấp trong điều kiện rất nhẹ so với các loại nhựa trao đổi. Đặc biệt, do những đặc điểm này nên cellulose trao đổi ion là các công cụ rất có giá trị cho tách, lọc và cách ly các chất không ổn định trong hóa sinh. 2.2.3.5-Diethylaminoethyl (DEAE) cellulose RO-C2H4-N(C2H5)2- DEAE cellulose - do phản ứng của alkalicellulose với 2-chloro-1-diethylaminoethane hydrochloride. Nhóm diethylaminoethyl của cellulose thông qua một nhóm ête gây ra sức mạnh tương đương với các loại nhựa trao đổi. Các nhóm cơ bản là nhóm có hóa trị I. DEAE cellulose trao đổi công suất khoảng 0,35 meq/g. - DEAE cellulose được sử dụng thường xuyên để trao đổi ion. Nó chủ yếu được sử dụng để lọc, tách và cô lập các protein, enzyme và hormone. - Chuẩn bị các lớp cellulose trao đổi ion: các lớp trao đổi ion cellulose được chuẩn bị như lớp chấp hấp phụ khác. 10-20 bột% cellulose được đồng nhất trong nước cất. Số lượng bột phụ thuộc về tính chất trương nở này. Trương nở nhiều là bất lợi vì sau khi hoàn thành lớp sẽ làm khô xuất hiện vết nứt. Điều này đặc biệt đúng đối với các lớp trao đổi dày, tuy nhiên, nó có thể được ngăn ngừa bằng cách thêm vào một tỷ lệ % nhỏ của cellulose chưa sửa đổi MN 301. Kích hoạt trong tủ sấy ở nhiệt độ cao là không cần thiết. Để khả năng tái tạo tốt của sự phân ly thì điều quan trọng là các tạp chất phải được loại bỏ và các nhóm hoạt động có mặt trong hầu hết các hoạt động trao đổi. Các pha động sau đây được đề nghị cho trao đổi ion cellulose:
- Cellulose trao đổi ion cho TLC được sử dụng để tách các thành phần acid nucleic và nucleotide, coenzyme, steroid sulphate, protein, este phosphate, đường phosphate, vitamin, acid amin và các hợp chất khác. 2.2.4PolyamidePolyamide thường được sử dụng cho sắc ký lớp mỏng, vì nó phù hợp cho tách phenol và các hợp chất phenolic. Để phân tách hợp chất non-phenolic, sắc ký phân bố và các hiệu ứng khác phải được xem xét. 2.2.4.1Cấu tạo, trạng tháiCác lớp mỏng polyamide bao gồm các hạt nhỏ, tuy nhiên lớn hơn nhiều so với các phân tử pha động hay chất cần phân tích. Trên bề mặt và trong các hạt có các nhóm chức năng, nhóm peptide, nhóm amin và nhóm carboxyl đầu cuối. 
2.2.4.2Cơ chế- Do sự hình thành các liên kết hydro thuận nghịch giữa các nhóm chức của mẫu với nhóm oxy carbonyl (>C=O...). Pha động và các chất cạnh tranh liên kết hydro, vì thế nếu chọn pha động phù hợp ta có thể tách những liên kết hydro giữa chất nền và vật liệu hấp phụ. - Pha động chảy qua các lỗ hổng giữa các hạt. Lực giữa các phân tử của pha động và các nhóm chức năng của các polyamide khác nhau tùy vào sự xuất hiện của các phân tử và các nhóm liên quan, gồm: ion, chất lưỡng cực, chất cho/nhận điện tử, chất cho/nhận hydro...dẫn đến sự hình thành của các liên kết. Trong quá trình sắc ký, phân tử pha động đầu tiên sẽ gặp các nhóm chức năng trên bề mặt của các hạt và bão hòa tùy thuộc các loại tương tác. Nhiều phân tử pha động sẽ liên kết với các trung tâm này cho đến khi màng chất lỏng được hình thành ổn định trên bề mặt của hạt. Ngoài ra, các phân tử từ màng chất lỏng này có thể tiếp xúc với bên trong của hạt tùy thuộc vào cấu trúc và tính phân cực của chúng. Ở đó, nó có thể bão hòa nhiều nhóm chức năng và liên kết hydro giữa các chuỗi polymer bị phá vỡ. Nhiều phân tử pha động có thể tích lũy ở các trung tâm này và kết quả là các polyamide nở ra và có thể bị hòa tan. - Pha tĩnh polyamide bao gồm một màng chất lỏng trên bề mặt và một lớp phồng lên bên trong hạt, mà các tương tác giữa các phân tử pha động và các nhóm chức năng không phải là quá thấp. Trong sắc ký, các chất được phân tách nhờ sự phân bố giữa pha động và pha tĩnh (theo phương trình Nernst cho sự phân bố). Ngoài ra, chất phân tích cạnh tranh trong hấp phụ/giải hấp với các phân tử pha động bão hòa các polyamide. - Người ta phải xem xét hai hiệu ứng chồng lên nhau, ảnh hưởng sự phân chia tùy thuộc vào pha động cũng như vào chất phân tích. Việc chọn lựa pha động rất khó khăn do không có một dự báo chính xác về chỉ số Rf, tuy nhiên ban đầu vẫn có thể giới hạn các pha động. 2.2.4.3Ưu điểm vượt trội của polyamide so với các chất khác- Do tính chất trương nở của polyamide nên nó có khả năng hấp phụ cao. Vì vậy, nó là phù hợp với sắc ký và phân tích các vật liệu sinh học. Polyamide được áp dụng để phân lập và xác định các chất tự nhiên với phenolic và nhóm polyphenolic, ví dụ: anthocyanins, anthoxanthines, các dẫn xuất anthraquinon và flavon. - Polyamide có tính phân cực trung bình nên có thể phát triển theo hai chiều là sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo. Các chất đều có thể được tách riêng trên polyamide không phụ thuộc vào số lượng nhóm phân cực, cấu trúc không gian, các hợp chất đồng phân. Các vật liệu hấp phụ ưa nước polyamide 6 (Nylon 6 = Perlon = ε- aminopolycaprolactame) có hoặc không có phát huỳnh quang. - Polyamide là amid hữu cơ không ổn định đối với thuốc thử acid và base, do đó với polyamide không phá hủy khi phát hiện dưới ánh sáng tia cực tím được ưa chuộng. Phương pháp này đặc biệt thích hợp cho phenolic và hợp chất polyphenolic tự nhiên:
- Polyamid chủ yếu của các loại Perlon (Polycaprolactam), loại Nylon polyhexamethylenediamine adipate) hoặc loại Polyclar (Polyvinylpyrroli-một,PVP). Chúng phải được xử lý trước với MeOH và H2O. Tất cả đều có công suất cao cho nhóm hydroxyl phenolic thông qua cacbonyl amid.Cũng giống như cellulose, polyamide phù hợp với tách tất cả các loại flavonoids. - Tuy nhiên, nó có lợi thế hơn cellulose là năng lực và độ phân giải cao hơn. Ngoài ra, nó sử dụng dung môi khác với sắc ký giấy nên hai phương pháp này bổ sung, thay vì trùng lặp nhau. Các tài liệu hiện hành các ví dụ trong trong đó sắc ký cột đã được sử dụng cho tách flavonoid, đặc biệt là tách anthocynidin khi sử dụng dung dịch HCl 0.25N làm dung môi. Đối với việc phân chia các aglycones flavonoid, dung môi khan có vẻ là hài lòng nhất. 2.2.5Silicagel ghép2.2.5.1Cấu tạo, trạng thái, biến đổia. Bề mặt vật liệu silicagel được biến đổi - Vật liệu bao gói được dùng trong sắc ký pha đảo (cơ chế phân bố) được biến đổi với mục đích chính để tạo một lớp bao bề mặt phân cực của vật liệu gốc tạo thành bề mặt kỵ nước thể hiện một lực hút phân bố với các chất phân tích. - Trong vật liệu bao gói có lỗ với kích thước lỗ trung bình 10 nm, 99% bề mặt tiếp xúc nằm bên trong các lỗ. Việc chuyển đổi lượng lớn lỗ silica với mật độ cao silanol (4.8 nhóm/nm2) vào bề mặt kỵ nước cần tạo một lớp liên kết hữu cơ tương đối dày đặc để tạo lớp lá chắn trên bề mặt vật liệu silica cơ bản.
- Các loại phản ứng để biến đổi: Quá trình biến đổi bề mặt thân nước của vật liệu silicagel cơ bản có hơn 90% các loại pha tĩnh dùng trong HPLC thương mại được tạo nên bởi phản ứng biến đổi với alkychorosilane, phản ứng: Si-OH + Cl-Si(Me)2-n-alkyl = Si-O-Si(Me)2-n-alkyl + HCl HCl được tạo ra như sản phẩm phụ, cần loại bỏ trong quá trình tổng hợp. phần lớn silicagel được liên kết với nhóm metyl, tuy nhiên một số nhóm cũng được dùng như propyl hay tert-butyl. Trên bề mặt silica, silanols có thể phản ứng với alcohols tạo thành liên kết Si-O-R, phản ứng: Si-OH + HO-alkyl = Si-O-alkyl + H2O Loại phản ứng này cho phép tạo được liên kết với mật độ cao, nhưng sản phẩm phân hủy của liên kết Si-O-R khá nhiều, vật liệu này cũng ít được dùng trong HPLC. Biến đổi hóa học trên bề mặt silica với chất cải tiến hydridosilane có nhiều ưu điểm: Si-OH + H3Si-R = Si-O-Si(H2)-R + H2 Sản phẩm phụ của phản ứng này là H2 , dễ dàng được loại khỏi phản ứng và tạo được liên kết với mật độ cao. - Bề mặt biến đổi với chlorosilane: Chlorosilanes thì dễ bay hơi và rất nhạy cảm với sự hiện hiện của vệt nước. Phản ứng gắn kết ở pha khí phải được kiểm soát chặt chẽ sự có mặt của nước bằng cách cho chlorosilane phản ứng với aerosil (loại silica vi hạt không xốp): Si-OH + ClnSiMe4-n → Si-O + SiMe4-nCln-1 + HCl Chính vì thế chỉ có một phần bề mặt silanol tham gia phản ứng. Khả năng thành lập các cầu nối liên kết: 
Phân tích khoảng cách giữa các phân tử trong liên kết này cho thấy khoảng cách giữa các nhóm silanol ở bề mặt xấp xỉ 2.5 A, phù hợp với khoảng cách trong β-crystobalit và tạo được mật độ nhóm silanol khoảng 8 nhóm/nm2 . Phản ứng silanization trong pha lỏng (thường là dry toluene) là kỹ thuật thuận tiện hơn, mặc dù việc khó kiểm soát sự có mặt của nước trong phản ứng có thể dẫn đến quá trình thủy phân chlorosilanes. Khi dùng chất gắn kết một nhóm chức đều làm giảm mật độ silanols ở bề mặt đến 50% (tùy thuộc loại alkyl) so với vật liệu silica cổ điển (7.6 µmol/ m2), khi dùng chất có 2 nhóm chức thì chỉ hơi làm giảm mật độ silanols khoảng 12%, nếu dùng chất có 3 nhóm chức cho thấy sự tăng rõ ràng số lượng silanols. Điều này chứng minh thực tế phản ứng thủy phân nhóm clo của các chất biến đổi alkyl có 2 hay 3 nhóm chức và những nhóm chức biến đổi của chúng thành nhóm silanols Nồng độ bề mặt silanol thay đổi sau khi biến đổi công thức hóa học : 
K Khi dùng chất biến đổi có 3 nhóm chức :
Các chất phản ứng có 2 hay 3 nhóm chức thường dùng để tạo nên sự sắp xếp đặc thù gọi là các liên kết polymer. Ngày nay vẫn chưa có kết luận chính thức về khả năng tạo nên sự sắp xếp đặc thù các cầu nối liên kết, nhưng đa số đồng ý rằng không nên có quá 15% tổng số liên kết. Để tạo nên các sắp xếp đặc thù của liên kết thì khoảng cách giữa các bề mặt silanol nên gần giống với β-kristobalite (khoảng 2 A), phù hợp với mật độ cao của nhóm silanols bề mặt (4.8 nhóm/nm2). N Khả năng tạo các sắp xếp đặc thù của liên kết 3 nhóm chức thì không đáng kể. Trong đa số các trường hợp các chất phản ứng 2 hay 3 nhóm chức sẽ tiến hành polymer hóa với sự có mặt của water forming linear (chất biển đổi 2 nhóm chức) và alkoxysilanes nhánh (chất biến đổi 3 nhóm chức). Các vết nước vẫn luôn hiện diện trên bề mặt của silica phân cực.
Trên các vật liệu có lổ với kích thước lỗ nhỏ dưới 80Ǻ, những hạn chế do cản trở về không gian làm khó đạt được mật độ liên kết cao. Trong trường hợp đó liên kết hỗn hợp với sự phân bố ngẫu nhiên các ligands alkyl mạch ngắn và mắt xích dài cho phép che chở tốt hơn cho bề mặt lớp silica phân cực. 
- End- capping : Quá trình silanol hóa (silanization) thứ cấp với TMS (trimethylsilanes) thường được thực hiện với mục đích bao các nhóm silanol còn dư còn hoạt tính sau bước biến đổi chính. Theo những bàn luận ở trên thì chỉ khoảng 50% nhóm silanol thực sự tham gia vào phản ứng với chất biến đổi, còn lại thì không phản ứng, người ta gọi là nhóm silanol còn dư nằm bên dưới các liên kết alkysilanes kế cận hoặc nằm giữa các đám liên kết. Chính những nhóm silanol còn dư hoạt tính đó đã gây ra nhiều ảnh hưởng không mong muốn trong quá trình sắc ký pha đảo HPLC (pic kéo đuôi, các pha liên kết không ổn định…). Giải pháp cho vấn đề này là thực hiện quá trình end-capping, sử dụng các nhóm ligands nhỏ có thể len lỏi qua các ligands C18 để phản ứng với các nhóm silanol dư này và làm bất hoạt nhóm này. T
- Pha alkyl (C1 - C18, C30) : Có trên 90% các cột sắc ký pha đảo là dùng pha liên kết alkyl. Việc sử dụng pha đảo trong phân tích các hợp chất không phân cực và không ion hóa thường dùng C1< C4< C8 = C18 (phân chia theo mức độ thông dụng). - Pha loại phenyl : Pha loại phenyl cũng đã được nghiên cứu trong một khoảng thời gian dài. Sự hiện diện của các vòng phenyl trên bề mặt của pha liên kết tạo thành liên kết π-π với một số chất phân tích có thể tạo liên kết đó. - Pha tĩnh được bao bởi các chất phân cực : Việc cho ra đời pha tĩnh được bao bởi chất phân cực để đáp ứng nhu cầu phát triển phương pháp sắc ký pha đảo sử dụng pha động có lượng nước cao trong phân tách các chất phân cực và ionic. Do bề mặt kỵ nước của vật liệu liên kết hoá học đã hạn chế việc sử dụng các pha động có nước. Khi sử dụng pha động có nước tinh khiết trong một thời gian sẽ làm hư hại pha tĩnh. Nguyên nhân là do các liên kết ligands alkyl bị ˝gãy˝ nên không cho phép thấm các chất phân tích vào các dây mắc xích liên kết. Người ta có thể cải thiện bằng cách tăng số lượng liên kết giữa các dây mắc xích lên tối đa để làm giảm tối thiểu năng lượng của chúng. Những nghiên cứu cho thấy khả năng kết dính của lớp liên kết alkyl cao gấp 3 lần khả năng tương ứng ở các n-alkane tự do. Tuy nhiên n-octadecyl là chất rắn ở nhiệt độ phòng, do đó dây octadecyl được cố định trên bề mặt như vật liệu cứng rắn. Pha tĩnh được bao bởi chất phân cực bao gồm dây nối được bao bởi các nhóm phân cực không ion. Symmetry RP 18 (Waters), supelcosil ABZ (supelco) là những ví dụ cho loại liên kết này:
Ngoài ra ta có thể gặp các loại khác trong thương mại như: Xbridge Shield RP-18 (waters), synergy polar RP, synergy hydro-Rp (phenomenex), Zorbax SB- AQ (Agilent), YMC-Pack ODS-AQ ( YMC)… Lý do thứ hai để tiến hành giới thiệu các nhóm phân cực bao các ligands liên kết là do các nhóm này tương tác với nhóm silanols dư, làm bất hoạt nhóm silanol dư này để tương tác với chất phân tích phân cực hoặc cơ bản. Các pha này cũng cho thấy sự khác nhau có ý nghĩa khi so sánh với pha tĩnh RP-C18. Trong một số trường hợp cho thấy có sự cải thiện hình dạng pic.
Liên kết ligands alkyl khá uyển chuyển, sự linh động của nó bị giới hạn bởi sự cố định hóa trên bề mặt, do đó khi có mật độ cao liên kết ligand thì sẽ làm giảm sự linh động giữa các mắt xích. Mục tiêu chính của việc biến đổi hóa học trên bề mặt vật liệu silicagel là tạo được dạng bề mặt thích hợp hơn với các loại tương tác chọn lựa xảy ra trong quá trình sắc ký. Năng lượng bề mặt phụ thuộc vào mật độ liên kết ligand, sự sắp xếp, phân bố, và hình dáng. Thêm nữa là mục tiêu làm ổn định sự thủy phân bằng cách tạo lớp bảo vệ thích hợp bằng liên kết neo. Lớp bảo vệ trên bề mặt vật liệu gốc để hạn chế ảnh hưởng của các nhóm silanol dư, đó là mục tiêu chính trong sự phát triển, cải tiến các vật liệu bao gói.
Hiệu quả của lớp bảo vệ tùy thuộc vào mật độ liên kết ligands, và sự phân bố trên toàn bộ bề mặt của vật liệu. Sự phân bố ligand trên bề mặt được chia thành 3 loại: ngẫu nhiên (random), đồng đều (uniform), co cụm (islands- like). Các loại phân bố khác nhau tùy thuộc vào điều kiện quá trình tổng hợp như: các loại chất xúc tác, nồng độ chất phản ứng, nhiệt độ, sự hiện diện của nước hấp thụ dư trên bề mặt chất nền. Sự sắp xếp các liên kết ligands trên bề mặt, hình dạng cấu tạo của các ligands, độ tập trung là những yếu tố quan trọng để xác định tác động của lớp bảo vệ. Hình dạng phân tử của nối ligands và mức độ tự do của nó tùy thuộc vào mật độ của liên kết. Sự bất động của ligands trên bề mặt làm hạn chế tính linh động của nó, khi so sánh tình trạng của phân tử C18 tự do (n-octadecyl) với octadecyl bất động, chúng ta có thể dự đoán tình trạng rắn của dây mắt xích bất động. Khi nghiên cứu về tính dẻo của lớp liên kết cho thấy tính dẻo của dây mắt xích alkyl trong lớp liên kết tăng xấp xỉ gấp 2 lần so với tính dẻo của n-alkalens tương ứng. 2.2.5.2Cơ chế tách của pha tĩnh silicagel-ghépKhi được ghép vào silicagel mạch nhánh C-8 hoặc C-18 sẽ đóng vai trò như một giá mang của pha tĩnh. Bình thường khi chưa được tẩm pha tĩnh (chưa được hoạt hóa) các mạch nhánh này nằm hỗn độn và sát vào cấu trúc silicagel. Khi được tẩm pha tĩnh (được hoạt hóa) thì các mạch nhánh này sẽ duỗi ra tạo thành một hệ thống các bó sợi che phủ bên ngoài cấu trúc silica gel. Hệ thống bó sợi sẽ lưu giữ vai trò một lớp dung môi hữu cơ có trong thành phần của pha động. Lớp dung môi hữu cơ này sẽ giữ vai trò một pha tĩnh lỏng. Khi pha động lỏng chứa mẫu đi qua hệ thống pha tĩnh lỏng này, một sự phân bố vào 2 pha sẽ hình thành. Bản thân các mạch sợi đã được duỗi thẳng của hệ thống silica gel ghép này cũng có tương tác với các mẫu kém phân cực, làm cho các mẫu kém phân cực này bị lưu giữ trong pha tĩnh lâu hơn. Các silicagel ghép được ứng dụng nhiều trong sắc ký pha đảo HPLC. Đây là những chất hoạt động chủ yếu theo cơ chế phân bố. 2.2.5.3Đặc điểm sử dụng, ứng dụngKhi sử dụng silicagel trong sắc ký pha đảo, chú ý trình tự dung môi sử dụng sẽ có độ phân cực giảm dần, và trình tự các chất tách ra khỏi hệ thống cũng sẽ có độ phân cực giảm dần. Áp dụng nhiều trong HPLC, đặc biệt là silicagel ghép RP (RP-8, nhất là RP-18), dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột tách các chất phân cực mạnh (flavonoid, tannin, polyphenol, một số glycoside,…), đến rất mạnh (amino acid, đường, polysaccharide ,…). 2.2.5.4Ưu, nhược điểm- Ưu điểm: Silicagel liên kết tạo được các pha tĩnh khác nhau về cơ chế và mức độ tác động: pha đảo (RP-8, RP-18), pha thuận, trao đổi ion… Ứng dụng trong việc phân tách các chất phân cực mạnh mà khi sử dụng cột silicagel pha thuận thường không đạt kết quả cao. - Nhược điểm:
2.2.5.5Yếu tố ảnh hưởng chất lượng pha tĩnh- Số lượng nhóm –OH tự do - Tính tan của mẫu thử trong các pha - Hệ số phân bố của các cấu tử trong mẫu thử(hệ số càng khác nhau càng dễ tách) - Kỹ thuật nâng cao chất lượng pha tĩnh: kỹ thuật end-capping biến –OH thành –OR, với R là mạch ngắn gồm 2-4C làm giảm số lượng –OH tự do 2.2.6Pha tĩnh diaion HP-20
2.2.6.1Giới thiệu chungDiaion là tên được điều chế nhờ quá trình trùng hợp giữa polymer styren và divinyl benzene ở dạng hạt do hãng Misubishi sản xuất. Diaion ngày càng được áp dụng nhiều trong kỹ thuật phân lập các hợp chất tự nhiên. Cũng như Silica gel của Merck, Sephadex của Pharmacia ; Diaion cũng có nhiều loại hoạt động theo cơ chế khác nhau, nhưng thông dụng nhất là các loại Diaion hoạt động theo cơ chế chủ yếu là phân bố kiểu pha đảo, tên chung Diaion HP (Diaion High Porous Polymer). Tuỳ theo kích thước hạt và đường kính của xoang, có 4 loại Diaion HP chính được sản xuất với ký hiệu Diaion HP-10, HP-20,HP-30 và HP-40, nhưng thông dụng nhất là loại HP-20. Một vài ví dụ về cấu trúc của HP-10, 20, 30, 40, 50: 
2.2.6.2C
|
hi –R là mạch phân cực (cyanopropyl -C3H6CN, aminopropyl –C3H6NH2 hoặc propandiol) ta có silicagel ghép pha thuận. Đây là các chất hấp phụ yếu so với silicagel không ghép.
