+ Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi

▫ Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.

▫ Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.

▫ Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành váng không chắc chắn.

→ Do những ưu điểm vượt trội nên Acetobacter xylinum được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa.

− Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa muối và phân giải peptone. Một số loài đòi hỏi một số vitamin nhất định như acid pantothenic, các acid amin như: valin, alanin, isoleucin, proline… và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S… ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó, các môi trường bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter

3. 
   Phân loại giống vi khuẩn Acetobacter
   

• 
  Acetobacter aceti: trực khuẩn ngắn, không chuyển động và chúng có thể liên kết với nhau thành chuỗi dài. Chúng bắt màu vàng với iod, có thể sống ở nồng độ cồn khá cao (11%) và có khả năng oxy hóa cồn tạo thành 6% acid acetic. Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 34⁰C. Nếu nhiệt độ cao quá 40⁰C sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. Ta thường thấy chúng phát triển trong bia.
  
• 
  Acetobacter schutzenbachii: trực khuẩn khá dài, tạo thành váng dày, và không bền vững, có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11.5% acid acetic do đó thường được sử dụng để làm dấm theo phương pháp nhanh (của Đức).
  
• 
  Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển hoá glucose thành acid gluconic hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như acid para-aminopenzoic, acid panthoteric, acid nicotinic.
  
• 
  Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo ra váng rất dày trên môi trường dịch thể, có thể phát triển được trong môi trường có nồng độ rượu cao (10% – 12%) và làm tích luỹ đến 9.5% acid acetic. Thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm (phương pháp của Pháp). Phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25 – 30⁰C.
  
• 
  Acetobater xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá dày. Váng có chứa cellulose nên khi gặp H₂SO₄ và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu xanh, có thể tích luỹ 4.5% acid acetic trong môi trường.
  
• 
  Acetobacter pasteurianum: trực khuẩn ngắn, váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc Iod, có khả năng oxy hoá và tạo 6.2% acid acetic.
  

1. 
   Ứng dụng của vi khuẩn Acetobacter
   

• 
  Sử dụng để làm thạch dừa
  
• 
  Sử dụng quá trình lên men
  

• 
  Người Trung Hoa ngày xưa đã biết chế một loại nước giải khát gọi là “vát chè”, đây là một loại nước có hương vị thơm dùng để pha chế thức uống giải khát trong gia đình rất bổ dưỡng.
  
• 
  Tiến hành pha như sau: pha đường 6 – 7%(có chè càng tốt), thêm một ít rượu 2 – 3%, cho vào để hở vài ngày, vi khuẩn sẽ tạo thành váng, nước hơi chua, lấy nước đem dùng, váng để lại cho lên men mẻ mới nhưng không cần phải cho rượu, chỉ cần cho thêm nước đường vào.
  
• 
  Làm dấm ăn (acid acetic): nước dừa bổ sung thêm đường cho đạt tới nồng chất khô 15%, đây là môi trường lý tưởng để lên men rượu và từ đó lên men dấm
  
• 
  Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hóa sorbic thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)…
  

5. 
   Phân lập giống vi khuẩn Acetobacter
   

Vi khuẩn Acetobacter có thể được phân lập từ dấm, rượu, bia, hoa quả, chuối chín, váng giấm... Ví dụ: muốn phân lập vi khuẩn acetobacter từ không khí, người ta pha rượu thành dung dịch 5 – 6% (hoặc theo kinh nghiệm dân gian, chỉ cần lấy một phần rượu hòa với 7 phần nước lã, đựng trong cốc miệng rộng, giữ ở tủ ấm 30⁰C trong 2 – 3 ngày. Rượu sẽ đục và trên bề mặt xuất hiện một váng mỏng. Lấy váng mỏng này pha loãng ra, và phân lập trên môi trường thạch dĩa.

Để ức chế sự phát triển của các loại nấm men Mycoderma (thường phát triển đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter), người ta bổ sung vào môi trường phân lập 1 – 1.5% acid acetic.

6. Giống Acetobacter xylinum

7. 
   Nguồn gốc
   

1. 
   Đặc điểm
   

• 
  A.xylinum là loại vi khuẩn hình que thẳng hoặc hơi cong dài khoảng 2μm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng di chuyển nhờ tiên mao. Chúng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí.
  
• 
  Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric (do phản ứng của hemicellulose)
  
• 
  Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH thấp hơn 5. Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng.
  
• 
  Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh
  
• 
  A. xylinum có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm. Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, lúc còn non, A. xylinum phát triển thành ừng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt. Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy.
  
• 
  Trong môi trường lỏng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48h, hình thành một lớp trong và ngày càng dày
  

Hình 7: vi khuẩn Acetobacter xylinum

9. 
   Sinh lý, sinh hóa
   

Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát triển ở 37⁰C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 25 – 30⁰C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 35⁰C và nồng độ ethanol lên đến 10%

Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetat

Một số đặc điểm khác:

Bảng 5: đặc điểm sinh hóa của A.xylinum

STT	Đặc điểm sinh hóa của A.xylinum	Hiện tượng	Kết quả
1	Oxy hóa ethanol thành acid acetic	Acid acetic tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo lớp cặn đục rõ	+
2	Catalasa	Sủi bọt khí	+
3	Sinh trưởng trên môi trường Hoyer	Sinh khối không phát triển	-
4	Chuyển hóa glucose thành acid	Vòng sáng xung quanh khuẩn lạc	+
5	Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton	Vòng CuO xuất hiện xung quanh khuẩn lạc	+
6	Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu	Không thấy sắc tố nâu	-
7	Kiểm tra tổng hợp cellulose	Váng vi khuẩn xuất hiện mà lam	+

1. 
   Cơ chế tổng hợp
   

• 
  A.xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào. Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme. Enzyme này có thể polyme hoá glucose thành cellulose.
  
• 
  A.xylinum tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy nước dừa có bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết. Cellulose là những polisaccharide không tan trong nước mà tan trong môi trường kiềm. Đó cũng là thành phần chính của màng tế bào thực vật.
  
• 
  Polysaccharide của vi sinh vật thường được tích tụ đáng kể trong các môi trường lỏng. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide. Lượng các oligo và các polysaccharide nội bào có thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào.
  

• 
  Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide. Đơn vị monosaccharide được thêm vào tham gia phản ứng ở dạng nucleotide, monosaccharide được hoạt hoá thường là dẫn xuất của các uridin diphosphat (UDP-X) nhưng đôi khi cũng với các nucleotide, purin và các pirimidin khác.
  
• 
  Sự tổng hợp diễn ra theo các phản ứng sau:
  

n nhánh (n+1) nhánh

• 
  Cơ chế quá trình sinh tổng hợp diễn ra theo sự tổng hợp các loại polysaccharide phân nhánh hiện chưa rõ.
  
• 
  Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào các enzyme transferase
  
• 
  Acetobacter xylinum sống thích hợp ở nhiệt độ 28-32^oC. Ở nhiệt độ này quá trình hình thành các sản phẩm trong đó có thạch dừa là tốt nhất.
  

• 
  Sự thay đổi pH trong quá trình lên men: một trong những điều kiện quan trọng trong để có được sự hoạt động sống của vi sinh vật là độ aicd của môi trường
  
• 
  Acetobacter xylinum là một loài chịu aicd nên môi trường được điều chỉnh về pH 3.5-4 bằng acid acetic 40%. Nhận thấy trong 4 ngày đầu pH tăng dần từ 3.78 tới 3.91 sau đó giảm dần đến ngày thứ 10 thì đạt giá trị là 3
  
• 
  Các quá trình đồng hóa, dị hóa của vi sinh vật có liên quan đến việc tạo thành các aicd hữu cơ như là sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối cùng của sự trao đổi chất. Nếu nguồn C không được vi khuẩn sử dụng hết thì có thể có sự tích lũy acid hữu cơ phụ thuộc vào từng chủng mỗi loài vi khuẩn, vào thành phần môi trường, vào sự thông khí và các thành phần khác. Đối với Acetobacter xylinum việc lên men đi liền với hình thành acid dicaboxylic không bay hơi (acid malic, fumaric..) các acid oxaloacetic, pyruvic như là các sản phẩm trung gian và các acid mono cacboxylic bay hơi như là sản phẩm cuối cùng
  

3. 
   Các nguyên liệu phụ khác
   

PHẦN 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THẠCH DỪA

1. Sơ đồ quy trình công nghệ

Nước dừa già

Lọc

Cặn

Bổ sung đường SA, DAP

Thanh trùng 10-45 phút

Làm nguội

Chỉnh pH

Lên men 10 – 12 ngày

Ngâm đường dịch đường

Thạch dừa thô

Tách khối cellulose

Rửa

Để ráo

Cắt nhỏ

Xả nước lạnh

(3-5% trong 10 phút)

2. Thuyết minh sơ đồ quy trình công nghệ

• 
  Nguyên liệu được sử dụng chủ yếu là nước dừa già thu nhận từ các nhà máy cơm dừa nạo sấy. Do nước dừa là môi trường lý tưởng với các thành phần dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi sinh vật nên không thể tồn trữ nước dừa trong điều kiện bình thường, nhiều ngày mà chỉ có thể tiếp nhận mỗi ngày với số lượng vừa đủ để sản xuẩt. Tuy nhiên, để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho sản xuất lâu dài thì cần có chiến lược về nguyên liệu dự trữ.
  
• 
  Ngoài ra, có thể sản xuất thạch từ các nguồn nguyên liệu khác từ rau quả như nước dứa (Sản phẩm gọi là Nata de pina), hỗn hợp nước dứa – nước dừa
  

Hình 8: Nước dừa