Microsoft Word 8 61. 16 Le Thanh Huong doc
tải về 3.47 Mb. Chế độ xem pdf
|
Phương-pháp-CTGDPT-2018 (1)
- Điều hướng trang này:
- Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại gen và xác định trình tự
| Mẫu phân tích
Ba mẫu Sâm Ngọc Linh (PV21, PV22, PV24), 4 mẫu Sâm Vũ diệp (PB03, PB04, PB05, PB06) và 3 mẫu Tam thất hoang (PS21, PS22, PS23) do Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng, Viện Ứng dụng công nghệ (Bộ Khoa học và Công nghệ) cung cấp. Mẫu sâm nuôi cấy in vitro (PV23) do Công ty cổ phần Khoa học Công nghệ Anh Đào, TP. Hồ Chí Minh cung cấp (Hình 1). Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại gen và xác định trình tự DNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp CTAB của Doyle và Doyle (Doyle và Doyle, 1990). Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên thông tin về trình tự gen trên Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank) (Bảng 1). Phản ứng khuếch đại các đoạn gen được tối ưu sử dụng điều kiện như sau: 20 µl tổng thể tích bao gồm: 50 ng DNA tổng số; 2,5 µM mỗi primer; 0,75 unit Taq DNA polymerase; 1 mM dNTPs và đệm tương ứng trên máy IBM Veriti với chu trình nhiệt như sau: 1 chu kỳ biến tính 94 o C/ 2 phút; 35 chu kỳ (94 o C/ 30 giây; 50-55 o C/ 30 giây; 72 o C/ 1 phút) và bước tổng hợp cuối cùng 72 o C/ 5 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8 %, sau đó được tinh sạch sử dụng bộ hóa chất GeneJET TM PCR Purification Kit (Hãng Thermo Scientific, Mỹ). Trình tự các đoạn DNA được xác định trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer theo nguyên lý của Sanger, với bộ kit BigDye®Terminator v 3.1 Cycle Sequencing (Hãng Applied Biosystems, Mỹ) bằng cách xác định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR. Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(1): 63-72, 2017 65 Bảng 1. Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu. Vùng DNA barcodes tải về 3.47 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|