Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu

5. Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu

- Số lượng mẫu: với mỗi vị trí thu rộng 50m², thu 10 mẫu ở các vị trí khác nhau, ký hiệu và đánh số vị trí, lưu lại trên bản đồ thu mẫu.

- Thu mẫu P. vittata từ các vùng ô nhiễm kim loại nặng ở các tỉnh khác nhau thuộc miền Bắc Việt Nam (như Hà Nội, Thái Nguyên, Bắc Giang, Tuyên Quang, Hà Giang…). Thời điểm thu hái được khuyến cáo là vào khoảng giữa 14-15 giờ để hạn chế tối đa những sai số liên quan đến chuyển hóa của cây vì trong khoảng thời gian đó chuyển hóa của cây là thấp nhất. Nhận dạng, giám định tên khoa học và lưu mẫu.

- Xử lý mẫu tuân theo quy trình của các nghiên cứu hệ chất chuyển hóa (Nguyễn và cs., 2015). Các mẫu cây được thu tươi, để nguyên vẹn, sau đó được rửa sạch bằng nước, chia thành 3 phần rễ, thân, lá rồi ngay lập tức được nhúng ngập vào Nitơ lỏng để các phản ứng chuyển hóa dừng lại. Sau đó các mẫu được đem đông khô đến khi khô hoàn toàn rồi xay nhỏ thành bột mịn. Bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -80°C cho đến khi phân tích.

Phân tích chỉ tiêu hàm lượng các kim loại nặng: Chì (Pb), Kẽm (Zn), Cadimi (Cd), Đồng (Cu), Asen (As), Sắt (Fe). Hàm lượng KLN được xác định bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Beaty và cs., 1993).

- Nguyên tắc của phương pháp: Dựa trên nguyên lý hấp thụ của hơi nguyên tử, khi chiếu vào đám hơi nguyên tử một năng lượng bức xạ đặc trưng của riêng nguyên tử đó, sau đó đo cường độ còn lại của bức xạ đặc trưng này sau khi đã bị đám hơi nguyên tử hấp thụ, từ đó tính ra được nồng độ nguyên tố có trong mẫu đem phân tích.

- Các bước tiến hành: 0.5 g mẫu thực vật được đem vô cơ hóa với 3 ml H₂SO₄ 95%, 10 giọt HClO₄ và 10 ml HNO₃ đậm đặc nóng (150-200°C) cho đến khi dung dịch mất màu hoàn toàn và trở nên trong suốt. Dung dịch được lắc đều và lọc qua giấy lọc để loại bỏ cặn trơ. Đối với các kim loại Cu, Pb, Zn, Cd và Fe 25 ml dung dịch được dùng và đối với As, 15 ml dung dịch được dùng pha với 10 ml nước cất trước khi cho vào máy đo. Với mỗi loại KLN, một bức xạ đặc trưng được sử dụng. Kết quả sau khi đo qua máy đo phổ hấp thụ nguyên tử được tính toán theo đường chuẩn riêng cho từng loại KLN để xác định nồng độ theo ppm hoặc ppb.

Dịch chiết của các mẫu thực vật thu thập được phân tích hệ chất chuyển hóa bằng cách sử dụng các quy trình chuẩn cho chiết xuất, sắc ký, phát hiện, xử lý số liệu.

• 
  Chiết xuất bằng dung môi thích hợp đáp ứng yêu cầu phân tích sắc ký. Quy trình chiết xuất được tối ưu hóa từ quy trình khuyến cáo bởi Golm Metabolome Database: 50 mg bột nguyên liệu được chiết với 300 µl Methanol phân tích (HPLC grade), 30 µl ribitol (đóng vai trò là chất chuẩn nội) trong 1 ống Eppendorf 2 ml. Hỗn hợp được trộn đều bằng máy rung trong vài giây rồi đặt trong bể siêu âm 1h trong 70°C, sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 rpm trong 5 phút. Dịch chiết được thu ra một ống Eppendorf khác, sau đó được thêm 200 µl CHCl₃, siêu âm tiếp trong vòng 15 phút ở nhiệt độ 37°C. 400 µl H₂O tinh khiết được thêm vào hỗn hợp để phân tách thành 2 pha. 300 µl dung dịch bên trên (pha nước) được dùng để phân tích các hợp chất phân cực, 300 µl dung dịch bên dưới (pha hữu cơ) được dùng để phân tích hợp chất kém phân cực.
  
• 
  Phân tích sắc ký: LC-MS.
  

Cột: Bond Elut C18 của Agilent Technologies

Gradient dung môi: Solvent A: H₂0 tinh khiết

Solvent B: Methanol

0-2 phút: 100 (A) 0 (B)

2-30 phút: 80 (A) 20 (B)

30-32 phút: 0 (A) 100 (B)

Tốc độ rửa giải: 1.2 ml/phút

Nhiệt độ cột: 40°C

Thể tích tiêm mẫu: 2 µl

• 
  Xử lý dữ liệu phân tích bằng cách sử dụng thuật toán XCMS trên ngôn ngữ R bao gồm các bước: Chuẩn bị dữ liệu phân tích dưới dạng file CDF, lọc pic, xác định các pic giống nhau trong từng sắc ký đồ của tất cả các mẫu, sửa thời gian lưu, thêm dữ liệu cho các pic còn thiếu, phân tích và mô hình hóa kết quả, định lượng các chất, định tính các pic (Smith 2012).
  
• 
  Định tính các peak bằng thư viện phổ NIST09 và thư viện tự tạo bằng các chất chuẩn. Các cấu trúc phức tạp hơn được phân tích bằng cách so sánh phân mảnh ion và thời gian lưu với các tài liệu tham khảo hoặc cơ sở dữ liệu về hệ chất chuyển hóa như Metlign, Golm...
  
• 
  Dùng các phương pháp thống kê một biến, nhiều biến như PCA, T-test, ANOVA, PLS-DA… để làm rõ các thay đổi về mặt chuyển hóa trong các mẫu.
  

Hoạt tính chống oxy hóa: dựa theo phép thử quét gốc tự do DPPH hoặc gốc Hydroxyl (OH^). Phương pháp DPPH được sử dụng rất rộng rãi để xác định hoạt tính chống oxy hóa sơ cấp do rất nhạy với các hợp chất đặc trưng hoặc các chiết xuất thực vật (Bondet và cs., 1997). Khi chất chống oxy hóa phản ứng với DPPH, các gốc tự do ổn định trở thành cặp do sự tồn tại của chất cho Hydro và DPPH được khử thành DPPHH (Diphenylpicrylhydrazine) và kết quả là độ hấp thụ giảm từ DPPH đến DPPH-H gây ra mất màu tím của DPPH và chuyển thành màu vàng của DPPH-H. Khả năng chống oxy hóa được đặc trưng bởi các giá trị IC₅₀ (nồng độ ức chế của mẫu cần thiết để quét được 50% gốc DPPH). Phép thử quét gốc tự do Hydroxyl dựa trên phản ứng tạo ra các gốc tự do hydroxyl kết hợp với deoxyribose gây ra sự phân giải của đường và nhiễm sắc hồng với TBA (Thiobarbituric acid). Khả năng quét gốc hydroxyl được đo theo phương pháp của Halliwell (Halliwell và cs., 1988). Acid ascorbic được dùng làm đối chứng dương trong cả hai phép thử trên.

Mối tương quan giữa hai giá trị được coi là có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 0,05 và điều chỉnh cho nhiều phép thử bởi tỷ lệ phát hiện sai được chấp nhận. Hệ số tương quan Pearson giữa các hàm lượng KLN, tất cả các chất chuyển hóa thứ cấp và các hoạt tính sinh học sẽ được tính toán. Bằng cách chọn một hệ số tương quan ngưỡng ví dụ lớn hơn ± 0.8, các tương quan cao hơn ngưỡng này sẽ được chọn để mô phỏng trong một mạng lưới tương quan bằng phần mềm Cytoscape (Shannon và cs., 2003).

Hệ số tương quan Pearson được dùng để đánh giá tương quan giữa 2 biến theo công thức:

_ (Chok 2010) Trong đó: _{ }

Hệ số tương quan đo lường độ mạnh yếu của một mối quan hệ tuyến tính của các cặp dữ liệu: -1 ≤ r ≤ 1. Giá trị dương của hệ số tương quan thể hiện tương quan tuyến tính tỷ lệ thuận, ngược lại giá trị âm thể hiện tương quan tuyến tính tỷ lệ nghịch. Giá trị 0 thể hiện không có tương quan tuyến tính. Giá trị r càng gần 1 hoặc -1, tương quan tuyến tính càng mạnh: .00-.19: rất yếu: .20-.39: yếu; .40-.59: trung bình; .60-.79: mạnh; .80-1.0: rất mạnh.

6. Kế hoạch triển khai

Đề tài dự kiến được thực hiện trong 3 năm từ 01/04/2017 đến 31/03/2020.

Nội dung, công việc chủ yếu (các mốc đánh giá chủ yếu)	Sản phẩm cần đạt	Thời gian (bắt đầu, kết thúc)	Người, cơ quan thực hiện
Nội dung 1: Thu thập và xử lý mẫu P. vittata	Hồ sơ tiêu bản và ảnh chụp các mẫu nghiên cứu. 70-80 mẫu P. vittata	04-10/ 2017	TS. Lê Hồng Luyến Khoa Công nghệ sinh học Nông Y Dược - Trường ĐH KHCN Hà Nội
Nội dung 2: Phân tích hàm lượng KLN.	Báo cáo kết quả phân tích hàm lượng KLN trong các mẫu rễ, thân, lá thực vật.	04-10/ 2017	TS. Mai Hương, ThS. Trịnh Bích Ngọc Khoa Nước – Môi trường – Hải Dương học, trường ĐH KHCN Hà Nội
Nội dung 3: Phân tích hệ chất chuyển hóa (metabolomics).	- Hệ chất chuyển hóa metabolome. - Gửi đăng kết quả	10/2017 - 10/2018	TS Nguyễn Thị Kiều Oanh. Khoa Công nghệ sinh học Nông Y Dược - Trường ĐH KHCN Hà Nội
Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa	- Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa.	10/2018 - 10/2019	PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt, DS Nguyễn Thị Hương - Khoa Công nghệ sinh học Nông Y Dược - Trường ĐH KHCN Hà Nội
Nội dung 5: Phân tích mạng lưới tương quan	- Mạng lưới tương quan giữa hàm lượng KLN, nồng độ hợp chất, hoạt tính sinh học - Gửi đăng kết quả	06/2019 – 02/2020	TS. Nguyễn Thị Kiều Oanh - Khoa Công nghệ sinh học Nông Y Dược - Trường ĐH KHCN Hà Nội
Báo cáo tổng kết khoa học	Báo cáo theo qui định	02-03/ 2020

7. Dự kiến kết quả đề tài

0. 
   7.1. Dự kiến kết quả nghiên cứu
   

Dự kiến kết quả nghiên cứu

Phát hiện mới: Đề tài dự kiến thu được các kết quả mới sau:

- Đánh giá về khả năng làm sạch môi trường của thực vật sống ở một số vùng khai thác kim loại nặng thuộc các tỉnh miền Bắc Việt Nam.

- Phát hiện về các loài thực vật siêu tích tụ kim loại sống ở vùng có hàm lượng kim loại cao có khả năng thay đổi chuyển hóa, ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của thực vật.

- Có một hiểu biết sâu hơn về mối quan hệ tương quan giữa kim loại nặng – HCTC – hoạt tính, từ đó hé lộ hợp chất nào đóng vai trò quan trọng trong cơ chế thích nghi của thực vật với điều kiện khắc nghiệt về KLN, góp phần làm sáng tỏ cơ chế phòng vệ của thực vật siêu tích tụ.

Phương pháp mới:

Đề tài dự kiến hoàn thiện phương pháp nghiên cứu hóa thực vật mới theo cách tiếp cận phân tích hệ chất chuyển hóa (metabolomics) kết hợp xử lý dữ liệu bằng các phép phân tích đa biến và mạng lưới tương quan giữa các yếu tố tác động lẫn nhau trong hệ thống sinh học.

Ý nghĩa khoa học:

Đề tài này cung cấp cơ sở khoa học cho việc giải quyết các vấn đề của môi trường do hoạt động khai thác kim loại của con người gây ra ở các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam. Đề tài cũng góp phần làm sáng tỏ cơ chế tác động của hàm lượng KLN đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong thực vật siêu tích tụ.

Đề tài cũng dự kiến đào tạo các nhà nghiên cứu trẻ, xây dựng mạng lưới nghiên cứu chuyên sâu giữa các nhà khoa học trong nước và quốc tế.

Khả năng sử dụng kết quả nghiên cứu:

Đề tài dự kiến có thể đưa ra các giải pháp xử lý môi trường bằng cách trồng các loài thực vật siêu tích tụ kim loại, đồng thời tạo nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt.

0. 
   7.2. Dự kiến công trình công bố
   

   Số TT	Kết quả công bố	Số lượng	Ghi chú
   1	Tạp chí ISI có uy tín
   2	Tạp chí quốc tế có uy tín	02	- 1 bài Q1 dự kiến trên Toxicology & applied pharmacology (IF 3.8 2015) - 1 bài Q2 dự kiến trên Phytochemistry (53/204 - IF 2.5 2015) hoặc Metabolomics (41/128 - IF 3.7 2015)
   3	Tạp chí quốc tế khác
   4	Tạp chí quốc gia có uy tín	02	- Tạp chí Công nghệ sinh học - Tạp chí Khoa học & Công nghệ
   5	Hội nghị khoa học quốc tế, quốc gia	02	- ASEAN-EU Science, Technology & Innovation Days - International conference on Metabolomics & Systems Biology
   6	Sách chuyên khảo
   7	Khác

1. 
   7.3. Dự kiến kết quả đào tạo (từ cao học trở lên)
   

Số TT	Kết quả đào tạo	Số lượng	Cơ sở đào tạo
1	Học viên cao học	02	Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội. 2 học viên cao học nằm trong thành viên của đề tài.
2	Nghiên cứu sinh

tải về 222.1 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: