Do Cơ quan điều hành Quỹ ghi

2. Tổng quan tình hình nghiên cứu và sự cần thiết tiến hành nghiên cứu

2.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.1. Nêu rõ những nghiên cứu do các nhà khoa học nước ngoài, trong nước tiến hành theo hướng nghiên cứu của đề tài và các kết quả đạt được, đồng thời nhận xét về những kết quả đã nêu.

2.1.1.1. Tổng quan về thực vật tích tụ kim loại nặng

Độc tính của KLN với các loài thực vật.

Cơ chế phòng thủ của thực vật chống lại độc tính của KLN.

Tiềm năng của các loài thực vật siêu tích tụ KLN và một số phương pháp sử dụng chúng hiện nay.

2.1.1.2. Ảnh hưởng của stress KLN lên chất chuyển hóa thứ cấp trong cây

Một trong những nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng nhất là các hợp chất phenolic. Phenolics là các hợp chất thứ cấp có ít nhất một vòng thơm (C6) mang một hoặc nhiều nhóm hydroxyl trong công thức cấu tạo, được chia thành nhiều nhóm nhỏ khác nhau, phân biệt bởi số lượng của các nguyên tử carbon kết hợp với cấu trúc của nhân phenolic cơ bản (phenol đơn giản, axit benzoic, phenylopropanoids và flavonoids). Các phenolic có chức năng khác nhau trong thực vật và hầu hết có hoạt tính chống oxy hóa. Sự tăng cường trao đổi chất phenylopropanoid và tăng hàm lượng các hợp chất phenolic có thể được quan sát dưới các stress KLN. Trong điều kiện stress kim loại nặng phenolic có thể tác dụng như các chất có khả năng tạo phức với kim loại hoặc có thể trực tiếp quét các phân tử oxy hoạt động. Cảm ứng sinh tổng hợp hợp chất phenolic được quan sát thấy trong lúa mì để đáp ứng với độc tính của Ni (Diaz và cs., 2001) và trong các cây ngô để đáp ứng với độc tính của nhôm (Kondo và cs., 2000). Loài Phaseolus vulgaris trong điều kiện phơi nhiễm với Cd²⁺ tích tụ nhiều hợp chất phenolic hòa tan và phenolic không hòa tan còn lá của loài Phyllantus tenellus sản xuất phenolic nhiều hơn so với nhóm chứng sau khi bị xịt đồng sulphate (Diaz và cs., 2001). Sự gia tăng của phenolics tương quan với sự gia tăng hoạt động của các enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa các hợp chất phenolic được báo cáo đã gợi ý có sự tăng tổng hợp phenolics dưới stress KLN. Ngược lại, một số bằng chứng cho thấy sự gia tăng nồng độ flavonoid chủ yếu là kết quả của sự liên hợp thủy phân (Parry và cs., 1994). Tăng phenolics hòa tan như chất trung gian trong quá trình tổng hợp lignin có thể phản ánh những thay đổi nhỏ điển hình gây ra bởi các stress KLN: tăng độ bền của thành tế bào và tạo ra các rào cản vật lý chống lại tác động có hại của các kim loại nặng (Diaz và cs., 2001). Trong những năm gần đây mối quan tâm đến các thuộc tính chống oxy hóa của các hợp chất phenolic ngày càng tăng (Cao và cs., 2012).

2.1.1.3. Mối liên quan giữa hàm lượng KLN và hoạt tính sinh học của thực vật tích tụ KLN.

2.1.1.4. Ứng dụng metabolomics vào việc tìm hiểu tương tác giữa KLN và HCTC trong thực vật.

Cách tiếp cận metabolomics có rất nhiều tiềm năng trong nghiên cứu các chất chuyển hóa trên thực vật, bao gồm các nghiên cứu về sự phát triển, sự biển đổi kiểu hình liên quan đến gen, phân tích kiểu gen và sinh học hệ thống. Metabolomics được ứng dụng như là một công cụ phân tích để phát hiện nhanh chóng và một cách đặc trưng các hợp chất được sản xuất bởi một sinh vật, với kiến ​​thức tương đối hạn chế về tính chất hóa học của chúng. Phân tích hệ chất chuyển hóa kết hợp với phân tích mạng lưới tương quan của các chất chuyển hóa thời gian gần đây đã tỏ ra hữu dụng trong việc tái thiết các con đường trao đổi chất (Krumsiek và cs., 2011), trong việc xác định các đáp ứng ở mức độ chuyển hóa với thay đổi của môi trường (Kotze và cs., 2013; Fukushima và Kusano, 2014), trong việc xác định các con đường có liên quan đến sự điều hòa của các quá trình sinh học (Albrecht và cs., 2014), và trong nghiên cứu chất điều hòa di truyền và các chiến lược áp dụng kỹ thuật chuyển hóa (Hu và cs., 2014).

Metabolomics còn cho phép các nhà nghiên cứu điều tra các cơ chế thích ứng của thực vật dưới ảnh hưởng của các tác nhân có hại như hạn hán, nhiễm mặn, nhiễm độc và nhiệt độ khắc nghiệt. Để thích ứng với hoàn cảnh bất thường thực vật thường tăng tổng hợp và tích lũy một số chất, chẳng hạn như các polyphenol. Metabolomics cho phép xác định những thay đổi mức độ của các chất chỉ điểm quan trọng và một loạt các chất chuyển hóa khác, cung cấp một cái nhìn tổng quan chính xác hơn về phản ứng của thực vật khi bị stress (Yuliana và cs., 2011, Verpoorte và cs., 2005).

Đặc biệt, Lee và cộng sự mới đây đã dùng cách tiếp cận này để phân tích hệ chất chuyển hóa và tìm ra mối tương quan giữa nồng độ hợp chất thứ cấp của các loài việt quất (Blueberries – Vaccinium spp.) với hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Thông qua mạng lưới tương quan được xây dựng bằng việc tính toán sự biến thiên của nồng độ các chất chuyển hóa và sự biến thiên của hoạt tính chống oxy hóa thu được, các tác giả đã bước đầu xác định được vai trò của các chất chuyển hóa trong việc đóng góp vào một hoạt tính sinh học cụ thể là hoạt tính chống oxy hóa (Lee và cs., 2014). Nghiên cứu này đã chứng tỏ khả năng sử dụng cách tiếp cận mới metabolomics đối với việc xác định xem chất nào đóng vai trò chính gây ra hoạt tính sinh học của một loài thực vật mà không cần tách chiết chất sạch để thử nghiệm trong khi nghiên cứu hóa thực vật truyền thống tập trung vào hoạt tính của một hoạt chất gây ra một tác dụng sinh học nhất định được chứng minh không phải là con đường tối ưu nhất của nghiên cứu hợp chất thiên nhiên từ khi xuất hiện khái niệm hiệp đồng tác dụng của các chất (hiện tượng mất hoạt tính khi hợp chất được tách riêng rẽ) (Verpoorte và cs., 2005).

2.1.2. Nêu mức độ cập nhật của các nghiên cứu trong nước so với các nghiên cứu mà các nhà khoa học của các nước tiên tiến đang tiến hành theo cùng hướng nghiên cứu. Những tổ chức khoa học đang tiến hành những nghiên cứu liên quan.

Những phương pháp truyền thống hiện đang áp dụng để xử lý KLN bao gồm các quá trình vật lý và hóa học, xử lý nhiệt (thiêu đốt), hay phương pháp chôn lấp…Hầu hết các phương pháp đều ứng dụng công nghệ phức tạp, tuy tốc độ xử lý các chất ô nhiễm nhanh nhưng ngược lại chúng đều khá tốn kém về kinh phí. Phương pháp loại bỏ KLN từ những vùng bị ô nhiễm bằng giải pháp công nghệ sinh học môi trường - sử dụng các loài thực vật trên hiện là giải pháp thân thiện với môi trường, đơn giản, dễ triển khai và hiệu quả về kinh tế. Các nghiên cứu ở Việt Nam trong sử dụng thực vật siêu tích tụ kim loại vì lẽ đó tập trung chủ yếu vào xử lý các khu vực bị ô nhiễm. Nghiên cứu hiện trạng ô nhiễm As ở Thái Nguyên, nhóm tác giả Đặng Đình Kim năm 2011 đã đề xuất hướng sử dụng một số loài thực vật để khắc phục thông qua đề tài cấp nhà nước KC08.04/06-10 “Nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng tại các vùng khai thác khoáng sản” (Đặng Đình Kim 2011). Pteris vittata & Pityrogramma calomelanos có khả năng tích lũy hàm lượng As từ 900 - 1500 mg/kg. Ngoài khả năng siêu tích lũy As, hai loài dương xỉ nghiên cứu có thể sử dụng cho xử lý Cd, Pb và Zn nếu cùng tồn tại ở hàm lượng thấp trong đất.

Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung theo hướng dùng thực vật siêu tích tụ để xử lý môi trường, chưa có các nghiên cứu theo hướng hóa sinh học các loài thực vật hấp thụ KLN, cụ thể là chưa có nghiên cứu về hàm lượng KLN tác động như thế nào đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp và hoạt tính sinh học của chúng. Về định hướng phân tích hệ chất chuyển hóa metabolomics, các nghiên cứu trong nước đã bắt đầu từng bước sử dụng cách tiếp cận này trong các nghiên cứu hóa thực vật, nhưng mới chủ yếu dừng lại ở mục đích phân tích dấu vân tay hóa học trong kiểm nghiệm dược liệu, các nghiên cứu định tính định lượng toàn bộ chất chuyển hóa trong một hệ thống sinh học còn rất hạn chế.

2.1.3. Nêu những kết quả nghiên cứu của chủ nhiệm đề tài đã đạt được theo hướng nghiên cứu của đề tài

2.1.3.1. Những kết quả nghiên cứu của chủ nhiệm đề tài đã đạt được

Tháng 12 năm 2014, chủ nhiệm đề tài đã có kỳ thực tập ngắn hạn tại phòng thí nghiệm UMR 5557, Trường Đại học Lyon 1 và phòng thí nghiệm BiOPI EA3900, Đại học Picardy Jules Verne Amiens, Cộng hòa Pháp để tiếp tục phát triển 2 đề tài: nghiên cứu hệ chất chuyển hóa bằng chất đánh dấu trong cây Isatis tinctoria L.; và phân tích chất chuyển hóa có hàm lượng vượt trội trong cây Pteris vittata L. sống ở vùng ô nhiễm kim loại của tỉnh Thái Nguyên (Nguyen và cs., 2015), trong đó nhiệm vụ số 2 chính là những nghiên cứu thăm dò ban đầu cho đề tài này.

Tháng 6 năm 2015, TS. Oanh nhận được học bổng thực tập tài trợ bởi quỹ Newton tại phòng thí nghiệm CNAP Metabolite profiling, khoa Sinh học, trường Đại học York, Vương quốc Anh, để thực hiện đề tài :”Phân tích hệ chất chuyển hóa trong 14 thứ Nghệ (Curcuma longa L.) thu hái từ 14 tỉnh thành ở Việt Nam”. Mục tiêu của đề tài là làm rõ sự khác nhau ở mức độ chuyển hóa của các thứ nghệ, từ đó góp phần xác định dấu vân tay hóa học với mỗi thứ nghệ ở các địa phương khác nhau. Hơn nữa, đề tài dự kiến tìm ra mối liên quan giữa nồng độ các curcuminoids (nhóm mang dược tính tốt) và các yếu tố thuộc về thổ nhưỡng khí hậu của các vùng đất trên để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố vô sinh lên hàm lượng các hợp chất có hoạt tính. Thông qua các phân tích chuyển hóa này có thể có hiểu biết sâu hơn về con đường sinh tổng hợp các curcuminoids, từ đó áp dụng các kỹ thuật chuyển hóa để cải tạo giống, tăng năng suất chất lượng của các hợp chất thứ cấp có tiềm năng.

2.1.3.2. Các nghiên cứu thăm dò theo hướng nghiên cứu của đề tài

Các loài cây mọc ở vùng đất mỏ bị ô nhiễm KLN đã được chọn dựa trên cơ sở lượng kim loại tồn tại trong các mô cây và khả năng làm sạch đất. Những công việc trước đây chúng tôi tiến hành đã chọn ra 4 vùng mỏ, gần làng mạc:

• 
  Xã Hà Thượng, Huyện Đại Từ, Tỉnh Thái Nguyên, nơi có các loài: Pteris vittata, Pityrogramma calomelanos, Dicranopteris linearis, Nephrolepia hirsutula.
  
• 
  Xã Yên Lãng, Huyện Đại Từ, Tỉnh Thái Nguyên, nơi có 1 mỏ than đang khai thác.
  
• 
  Làng Hịch, Xã Tân Long, Huyện Đồng Hỷ, Tỉnh Thái Nguyên, nơi có mỏ kẽm – chì và trồng các loài Pteris vittata, Eleusine indica và Polygonum hydropiper.
  
• 
  Xã Trại Cau, Huyện Đồng Hỷ, Tỉnh Thái Nguyên, nơi có mỏ sắt đang được khai thác.
  

Nghiên cứu về hoạt tính oxy hóa của 21 mẫu dịch chiết methanol thân - rễ - lá trên 7 cây thuộc các loài D. linearis, P. calomelanos, P. vittata thu hái ở Đại Từ - Thái Nguyên đã chỉ ra 11 mẫu được coi là có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 500 µg/ml và 6 mẫu ở nồng độ 100 µg/ml. Trong đó, hoạt tính quét gốc tự do cao nhất được tìm thấy ở loài D. linearis. Đáng chú ý là khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rễ cao hơn so với dịch chiết thân và lá, gợi ý giả thuyết các cây này tích tụ kim loại trong rễ của chúng và tại đây xảy ra cơ chế kháng kim loại (Trần và cs., 2014).

Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các cây dương xỉ thu hái ở vùng ô nhiễm KLN cho thấy hoạt tính quét gốc tự do của dịch chiết các loài D. linearis, P. calomelanos, P. vittata cho kết quả khả quan so với đối chứng dương là ascorbic acid (Bảng 2).

Chúng tôi đã xác định được một số HCTC có mặt với hàm lượng vượt trội có ý nghĩa thống kê trong cây P. vittata thu hái ở Đại Từ - Thái Nguyên, so với cây làm chứng mọc ở vùng không ô nhiễm kim loại theo cách tiếp cận metabolomics sử dụng sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao UHPLC DAD ESI /QToF. Kết quả bước đầu cho thấy 30 chất được phát hiện ra là chất chuyển hóa thứ cấp trong cây. Thuật toán PCA (Principal Component Analysis - phân tích thành phần chính) được thực hiện với nồng độ trung bình của các chất chuyển hóa trong các mẫu cho thấy 6 hợp chất được tìm thấy với hàm lượng vượt trội trong khi 8 hợp chất có hàm lượng thấp hơn trong các cây sống ở vùng ô nhiễm KLN so với vùng không ô nhiễm (Hình 2). Xác định cấu trúc dựa trên các phân mảnh ion và thời gian lưu tương đối được báo cáo trong các tài liệu, chúng tôi cũng đã xác định được 3 chất có hàm lượng vượt trội và 4 chất có hàm lượng thấp hơn đều là các dẫn chất của acid caffeoyl-quinic (Bảng 3) (Nguyen và cs., 2015). Kết quả này tạo tiền đề cho chúng tôi tiếp tục phân tích hệ chất chuyển hóa của P. vittata trong đề xuất này.

Các kết quả nghiên cứu bước đầu này đã được công bố thành 1 bài báo và 2 poster trên 2 hội thảo quốc gia và quốc tế: Hội thảo hợp tác Khoa học công nghệ lần thứ nhất Việt Nam – Bulgari (The 1^st VAST-BAS Workshop on Science and Technology), Hội thảo hợp tác Khoa học ASEAN – EU (ASEAN-EU Science, Technology & Innovation Days 2015), Hội thảo STOLON – Lyon Cộng Hòa Pháp 20 – 23 tháng 7 năm 2015 (Tran và cs., 2014, Nguyen và cs., 2015; Pham và cs., 2015). Nghiên cứu cũng đóng góp vào việc đào tạo của trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội thể hiện qua khóa luận tốt nghiệp của các sinh viên cử nhân và thạc sỹ.

2.1.3.3. Những vấn đề còn tồn tại cần giải quyết dựa trên các kết quả nghiên cứu sơ bộ ban đầu

Từ kết quả ban đầu trong các nghiên cứu thăm dò, chúng tôi quyết định chọn loài Pteris vittata là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài này vì lý do:

- Đã có nghiên cứu cơ bản làm định hướng cho phân tích hệ chất chuyển hóa, trong đó các quy trình xử lý mẫu, chiết xuất mẫu, các thông số phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phổ khối đã được tối ưu.

- Nghiên cứu thăm dò chỉ ra dịch chiết P. vittata cho hoạt tính chống oxy hóa tương đối tiềm năng so với các đối chứng dương.

Trong các nghiên cứu thăm dò, chúng tôi đã sử dụng số lượng rất ít mẫu thực vật để phân tích hệ chất chuyển hóa (6 mẫu thực vật sống ở vùng ô nhiễm KLN và 1 mẫu đối chứng). Đối với các nghiên cứu hệ chất chuyển hóa, số lượng mẫu phụ thuộc vào mức độ biến thiên giữa các đối tượng. Thông thường, sự khác nhau càng nhỏ giữa các hệ thống sinh học đòi hỏi số lượng mẫu càng lớn thì phân tích mới đủ ý nghĩa thống kê. Vì vậy, chúng tôi dự định sẽ tăng số lượng mẫu và thu thập ở nhiều vị trí khác nhau để có thể sàng lọc thu nhận được nhiều thông tin hơn.

Nghiên cứu hệ chất chuyển hóa được tiến hành nhờ sử dụng rất nhiều kỹ thuật phân tích hóa học như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ thực hiện trên một số lượng mẫu lớn. Vì vậy, số lượng dữ liệu phân tích thu được là rất lớn và việc xử lý rất phức tạp. Do đó, việc khai thác các kết quả của nghiên cứu hệ thống chất chuyển hóa cần phải sử dụng các công cụ tin sinh để xử lý sơ bộ dữ liệu, chuẩn bị cho các phân tích thống kê (Sumner và cs., 2003). Các phần mềm như XCMS chạy trên ngôn ngữ lập trình R (Smith và cs., 2006) đã và đang được phát triển cho các nghiên cứu về chuyển hóa và được sử dụng để xử lý sơ bộ các files dữ liệu thu được sau các quá trình sắc ký khí/lỏng khối phổ. Ưu điểm của phần mềm này là: miễn phí, mỗi bước lập trình đều được quản lý chặt chẽ bởi người dùng, có thể sửa được thời gian lưu, có khả năng làm thẳng hàng các phổ sắc ký của hàng trăm mẫu một lúc, tính toán thống kê cho mỗi phân mảnh ion thu được trong phổ khối và có các chức năng mô phỏng kết quả tốt, thay giá trị tối thiểu (khác 0) cho các ion không tìm thấy trong sắc ký ở bảng dữ liệu. Tuy vẫn có các nhược điểm như phải sử dụng file dạng NetCDF/mzXML để xử lý, nhiều thông số phức tạp và phải chạy bằng các dòng lệnh trên ngôn ngữ lập trình R nhưng XCMS/R vẫn được coi là phần mềm tốt nhất có thể sử dụng trong nghiên cứu hệ chất chuyển hóa.

Mục tiêu của một nghiên cứu hệ chất chuyển hóa là so sánh hệ thống sinh học ở các điều kiện khác nhau và mô tả được thay đổi về mặt chuyển hóa giữa các mẫu. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phân tích đa biến được áp dụng trong các nghiên cứu metabolomics như phân tích thành phần chính PCA, phân tích phương sai ANOVA, phương pháp bình phương tối thiểu từng phần PLS-DA... có thể thực hiện dễ dàng trong ngôn ngữ lập trình R. Trong nghiên cứu thăm dò, chúng tôi đã sử dụng PCA như một phương pháp phân tích thống kê để làm rõ các chất chuyển hóa thứ cấp có hàm lượng vượt trội trong mẫu cây thu ở vùng ô nhiễm. Trong phạm vi đề tài này, các phân tích chuyên sâu hơn như PLS-DA có thể được thực hiện để đánh giá những thay đổi trong chuyển hóa và tương quan giữa hàm lượng KLN – hợp chất thứ cấp và hoạt tính sinh học.

Các mẫu thực vật tích tụ KLN được thu thập, tách chiết dịch chất thô và thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa. Tuy nhiên, các nghiên cứu thăm dò mới được thực hiện trên số lượng mẫu không lớn. Trong khuôn khổ của đề tài, các mẫu được phân tích chất chuyển hóa đồng thời với thử hoạt tính sinh học, vì vậy số lượng mẫu thử hoạt tính cũng sẽ tăng lên. Do đó cần phải tối ưu hóa quy trình thử hoạt tính sao cho có thể thử đồng thời một số lượng mẫu lớn.

Mạng lưới tương quan được tạo ra để làm rõ mối quan hệ giữa hàm lượng KLN – nồng độ HCTC – hoạt tính sinh học của chúng. Phân tích mạng lưới tương quan được coi như một công cụ hữu hiệu để tìm hiểu một hệ thống sinh học (Shannon và cs., 2003). Sau khi đo được hàm lượng KLN trong từng mẫu cây, định tính và định lượng được các chất chuyển hóa thứ cấp đồng thời xác định được hoạt tính sinh học của các dịch chiết, chúng tôi sẽ tính toán mối tương quan giữa các cặp đại lượng này để xây dựng mạng lưới tương quan giữa 3 đại lượng biến thiên: hàm lượng kim loại và nồng độ hợp chất thứ cấp và hoạt tính sinh học. Để xây dựng được mạng lưới này, số lượng mẫu thu về phải khá lớn. Trong nghiên cứu ban đầu, dữ liệu thu được rất ít do số lượng mẫu không đủ nên nội dung này chưa được thực hiện.