Phản ứng oxi hoá hỗn hợp 7 và 8 bằng tác nhân Jones

Cân 20 mg chất đầu vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 10 ml axeton (được làm lạnh đến -20^oC) vào bình để hoà tan chất. Sau đó thêm từ từ vào bình dung dịch 1 ml tác nhân Jones (tác nhân Jones được điều chế từ 27g CrO₃ và 23 ml H₂SO₄ đặc sau đó thêm 20 ml nước cất) sao cho nhiệt độ phản ứng không vượt quá -5^oC. Sau 5 phút phản ứng kết thúc, thêm isopropanol để phá hủy lượng dư tác nhân.

Sau phản ứng đổ hỗn hợp phản ứng vào nước, chiết dung dịch thu được khoảng 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng dung dịch Na₂CO₃ bão hòa đến pH = 7. Làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể hình kim màu trắng O1 (168) (16 mg). Hiệu suất phản ứng đạt 78,5%.

• 
  Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất O1:
  

R_f = 0,41 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H₂SO₄.

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và MCKane, L., & Kandel (1996).

• 
  Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
  
• 
  Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus.
  
• 
  Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.
  
• 
  Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.
  

+ Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+)

+ Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-)

+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men

Thuốc tháng sinh được pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin: 50 mM; Tetracylin: 10 mM; Nystatin: 0,04 mM.

Chứng âm tính:

Vi sinh vật kiểm định không trộn lẫn kháng sinh và chất thử

Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma.

Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.

Tiến hành thí nghiệm:

Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.

Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37^oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30^oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.

Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU< 5.

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) của chất có hoạt tính:

Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.

Kết quả thử hoạt tính được nêu ở phần 2.4.

Thực hiện nội dung nghiên cứu phân lập và chuyển hoá ent-kauran diterpenoid từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) và khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận được, luận văn đã thu được các kết quả như sau:

1. 
   Đã phân lập được các ent-kauran diterpenoid 1 và hỗn hợp 7 + 8 làm các chất đầu cho chuyển hóa.
   
2. 
   Các chất đầu này được chuyển hóa ở vị trí của các nối đôi và các nhóm chức hidroxy và cacbonyl để tạo thành các dẫn xuất mới. Đã thực hiện thành công phản ứng epoxi hóa ở nối đôi của các ent-kauran diterpenoid và mở vòng epoxit tạo thành nhờ thủy phân hoặc botriflorua eterat; đã thực hiện các phản ứng thủy phân, axetyl hóa và oxi hóa các ent-kauran diterpenoid thành các dẫn xuất dihydroxy, diaxetyl và dixeton tương ứng. Cấu trúc của các sản phẩm chuyển hóa đã được xác định bằng các phương pháp phổ.
   
3. 
   Đã thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật với các sản phẩm nhận được. Sản phẩm oxi hóa ent-kauran diterpenoid cho kết quả ức chế tốt đối với một số vi khuẩn và nấm.
   

1. 
   Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
   
2. 
   Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
   
3. 
   Phan Tống Sơn (1986), Hoá học các terpen và terpenoid, ĐHTH Hà Nội - ĐHTH Amsterdam, Amsterdam.
   
4. 
   Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh (1976, 1977), Thực hành hoá học hữu cơ (Organikum, dịch từ tiếng Đức), Tập 1, 2, Nhà xuât bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
   
5. 
   Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Taylor Water C. (1999), “Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hoá học, 37 (4), tr. 57 – 59.
   
6. 
   Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1976, 1980), Cơ sở Hoá học hữu cơ, tập 1, 2, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.
   
7. 
   Phan Tống Sơn, Lê Huyền Trâm, Phan Minh Giang (2002), “Đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hoá học, 40, tr. 53 – 57.
   
8. 
   Bế Thị Thuần, Trương Văn Như, Nguyễn Duy Khang (1991), “Góp phần nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá khổ sâm đối với một số vi khuẩn”, Tạp chí Dược học, 1, tr. 16 – 17.
   
9. 
   Bế Thị Thuần, Trương Văn Như (1991), “Nghiên cứu thành phần hoá học của cây khổ sâm và thăm dò tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 5, tr. 11 – 12.
   
10. 
    Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức (2007), Vi sinh vật thực phẩm, NXB Y học, Hà Nội.
    
11. 
    Trường Đại học Y Hà Nội – Bộ môn vi sinh vật (2003), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội.
    
12. 
    Viện dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
    

13. 
    Batista R., Braga F. C., Oliveira A. B. (1999), “Synthesis and trypanocidal activity of ent-kaurane glycosides”, Bioorganic & Medicinal Chemistry. 17, pp 381-391.
    
14. 
    Block S., Stevigny C., Gillet M. C. D. P., Hoffmann E. D., Uabres G., Adjakidje V., Leclercq J. Q. (2002), “Ent-trachylabdan-3β-ol, a new cytotocic diterpene from Croton zambesicus”, Planta Med. 68, pp. 647 – 649.
    
15. 
    Bruno M., Rosselli S., Pibiri I., Kilgore N., Lee K. H. (2002), “Anti-HIV agents derived from the ent-kaurane diterpenoids lineanol”, J. Nat. Prod. 65, pp.1594 – 1597.
    
16. 
    Erazo S., Zaldivar M., Delporte C., Backhouse N., Tapia P., Belmonte E., Monache F. D., Negrete R. (2002), “Antibacterial diterpenoids from Fabiana densa var. ramulosa”, Planta Med. 68, pp. 361 – 363.
    
17. 
    Phan M. G., Jin H. E., Phan T. S., Lee J. H., Hong Y. S., Lee J. J. (2003), “ent-Kaurane Diterpenoids from Croton tonkinensis Inhibit LPS-Induced NF-κB Activation and NO Production”, J. Nat. Prod. 66, pp. 1217 – 1220.
    
18. 
    Phan M. G., Otsuka H., Phan T. S. (2005), “Three minor ent-kaur-16-ene-type diterpene from Croton tonkinensis Gagnep”, Viet nam J. Chem. 43 (2), pp. 263 – 264.
    
19. 
    Phan M. G., Phan T. S., Lee J. J., Otsuka H., Wat C. Taylor (2003), “Chemical constituents and therapeutic potential of the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis GAGNEP. (Euphorbiaceae)”, Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and Other Natural Products (ASOMPS XI), October 2003, Kunming, China.
    
20. 
    Phan M. G., Phan T. S., Lee J. J., Otsuka H. (2004), “Four ent-kaurane – Type Diterpenoids from Croton tonkinensis GAGNEP”, Chem. Pharm. Bull. 52 (7), pp. 879 – 882.
    
21. 
    Phan M. G., Phan T. S., Hamada Y., Otsuka H. (2005), “Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis GAGNEP”, Chem. Pharm. Bull. 53 (3), pp. 296 – 300.
    
22. 
    Phan M. G., Phan T. S., Matsunami K., Otsuka H. (2006), “ Anti-staphylococcal activity of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis”, J. Nat. Med. 60, pp. 93-95.
    
23. 
    Han L., Huang X., Sattler E., Dahse H. M., Lin W., Grabley S. (2004), “New Diterpenoids from the Marine Mangrove Bruguiera gymnorrhiza”, J. Nat. Prod. 67, pp. 1620 – 1623.
    
24. 
    Han Q. B., Zhao A. H., Zhang J. X., Lu Y., Zhang L. L., Zheng Q. T ., Sun H. D. (2003), “Cytotoxic Constituents of Isodon rubescens var. lushiensis”, J. Nat. Prod. 66, pp. 1391 – 1394.
    
25. 
    Hanson J. R. (1999), Nat. Prod. Rep. 16, pp. 209 – 219.
    
26. 
    Jiang B., Hou A. J., Li M. L., Li S. H., Han Q. B., Wang S. H., Lin Z. W., Sun H. D. (2002), “Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon sculponeata”, Planta Med. 68, pp. 921 – 925.
    
27. 
    Jiang B., Yang H., Li M. L., Hou A. J., Han Q. B., Wang S. J ., Sun H. D. (2002), “Diterpenoids from Isodon adenantha”, J. Nat. Prod. 65, pp. 1111 – 1116.
    
28. 
    Li S. H., Niu X. M., Peng L. Y., Zhang H. T., Yao P., Sun H. D. (2002), “ent-Kaurane Diterpenoids from the Leaves of Isodon xerophilus”, Planta Med. 68, pp. 946 - 948.
    
29. 
    Marquina S., Parra J. L., González M., Zamilpa A., Escalante J., María R., Laura Álvarez L. (2009), “Hydroxylation of the diterpenes ent-kaur-16-en-19-oic and ent-beyer-15-en-19-oic acids by the fungus Aspergillus niger” , Phytochemistry. 70, pp. 2017–2022.
    
30. 
    Minh P. T., Ngoc P. H., Walter C. T., Cuong N. M. (2004), “A new ent-kaurane diterpenoid from Croton tonkinensis leaves”, Fitoterapia. 75, pp. 552 – 556.
    
31. 
    Niu X. M., Li S. H., Li M. L., Zhao Q. S., Med S. X., Na Z., Wang S. J., Lin Z. W., Sun H. D. (2001), “Antiviral, Haemolytic and Molluscicidal Activities of Triterpenoid Saponins from Maesa lanceolata: Establishment of Structure-Activity Relationships”, Planta Med. 68, pp. 528 – 533.
    
32. 
    Perry N. B., Burgess E. J., Back S. H., Weavers R. T., Geis W., Mauger A. B. (1999), “11-Oxygenated cytotoxic 8,9-secokauranes from a New Zealand liverwort, Lepidolaena taylorii”, Phytochemistry. 50, pp. 423 – 433.
    
33. 
    Phan T. S., Phan M. G., Taylor W. C. (2000), “An ent-Kaurane Diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep”,  Aust. J. Chem. 53, pp. 1003 – 1005.
    
34. 
    Tang W., Hemm I., Bertram B. (2003), “Recent Development of Antitumor Agents from Chinese Herbal Medicines; Part I. Low Molecular Compounds”, Planta Med. 69, pp. 97 – 108.
    
35. 
    Vanden Berghe D. A., Vlietlinck A. J. (1991), Method in plant biochemsitry, ed. Hosttetman K., Academic Press, London.
    
36. 
    Wu Y. C., Hung Y. C., Chang F. R., Cosentino M., Wang H. K., Lee K. H. (1996), “Identification of ent-16β,17-Dihydroxykauran-19-oic Acid as an Anti-HIV Principle and Isolation of the New Diterpenoids Annosquamosins A and B from Annona squamosa”, J. Nat. Prod. 59, pp. 635 – 637.
    
37. 
    Wikens M., Alarcon C., Urzua A., Mendoza L. (2002), “Characterization of the Bactericidal Activity of the Natural Diterpene Kaurenoic Acid”, Planta Med. 68, pp. 452 – 454.
    
38. 
    Xiang W., Na Z., Li S. H., Li M. L., Li R. T., Tian Q. E., Sun H. D. (2003), “Cytotoxic Diterpenoids from Isodon enanderianus”, Planta Med. 69, pp. 1031 – 1035.
    
39. 
    Xu L., Wang F. P., (2005), “Exhaustive degradation of the ring D of 3,20-epoxy ent-kaurane-type diterpene maoecrystal A”, Tetrahedron. 61, pp. 4467-4474.
    
40. 
    Zamilpa A., Tortoriello J., Navarro V., Delgado G., Alvarez L. (2002), “Antispasmodic and Antimicrobial Diterpenic Acids from Viguiera hypargyrea Roots”, Planta Med. 68, pp. 281 – 283.
    
41. 
    Zhang H., Fan Z., Tan G. T., Chai H. B., Pezzuto J. M.., Sun H., Fong H. H. S. (2002), “Pseudoirroratin A, a New Cytotoxic ent-Kaurene Diterpene from Isodon pseudo-irrorata”, J. Nat. Prod. 65, pp. 215 – 217.
    
42. 
    Zhao Y., Niu X. M., Qian L. P., Liu Z. Y., Zhao Q. S, Sun H. D. (2007), “Synthesis and cytotoxicity of some new eriocalyxin B derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry. 42, pp. 494-502.