Tiªu chuÈn ngµnh 10 tcn 416-2000



tải về 38.02 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu15.08.2016
Kích38.02 Kb.

Tiªu chuÈn ngµnh

10 TCN 416-2000





ph­¬ng ph¸p b¶o qu¶n dµi h¹n

Nguån gen vi sinh vËt n«ng nghiÖp b»ng nit¬ láng



1. Ph¹m vi ¸p dông:

Tiªu chuÈn nµy ¸p dông cho viÖc b¶o qu¶n dµi h¹n vi sinh vËt dÞ d­ìng hiÕu khÝ vµ vi hiÕu khÝ sö dông trong n«ng nghiÖp (trõ vi sinh vËt trong lÜnh vùc thó y) d­íi d¹ng lµ tÕ bµo sinh d­ìng vµ bµo tö trong ®iÒu kiÖn v« trïng b»ng ph­¬ng ph¸p nit¬ láng.



2. ThuËt ng÷, ®Þnh nghÜa:

2.1. Vi sinh vËt n«ng nghiÖp: lµ c¸c lo¹i vi sinh vËt kh¸c nhau thuéc vi khuÈn, x¹ khuÈn, vi khuÈn lam, nÊm men, nÊm mèc ®ang lµ ®èi t­îng ®­îc nghiªn cøu vµ sö dông trong n«ng nghiÖp, ®­îc Bé n«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng th«n cho phÐp.

2.2. B¶o qu¶n vi sinh vËt: lµ b¶o qu¶n c¸c mÉu gièng thuÇn khiÕt sau khi ®· chän läc, trong ®iÒu kiÖn phï hîp ®Ó b¶o ®¶m ®é sèng sãt cao vµ b¶o tån c¸c tÝnh tr¹ng ban ®Çu.

2.3. B¶o qu¶n dµi h¹n: lµ b¶o qu¶n c¸c mÉu gièng trong thêi gian trªn 2 n¨m.

2.4. §Æc tÝnh sinh häc: lµ kh¶ n¨ng cña vi sinh vËt th«ng qua ho¹t ®éng sèng cña chóng cã t¸c dông ®Õn qu¸ tr×nh sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña c©y trång, vËt nu«i, kiÓm so¸t sinh häc vµ sinh th¸i m«i tr­êng.

2.5. M«i tr­êng nu«i cÊy chän läc: lµ m«i tr­êng chØ phï hîp cho sù sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña mét loµi hay mét nhãm vi sinh vËt nµo ®ã.

2.6. M«i tr­êng chÈn ®o¸n ph©n biÖt (m«i tr­êng chØ thÞ): lµ m«i tr­êng cho phÐp ph©n biÖt nhanh chãng mét lo¹i vi sinh vËt nµy víi c¸c lo¹i vi sinh vËt kh¸c.

2.7. MÉu gièng: lµ gièng do t¸c gi¶ thu thËp, chän läc, lai t¹o hay lÊy tõ quÜ gen cã tÝnh di truyÒn æn ®Þnh.

2.8. Thêi gian cÊy chuyÓn: lµ kho¶ng thêi gian gi÷a 2 lÇn cÊy ®Ó duy tr× c¸c tÝnh tr¹ng cña vi sinh vËt.

2.9. §é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng: lµ tû lÖ phÇn tr¨m cña sè l­îng tÕ bµo sèng sãt trong c¸c mÉu gièng b¶o qu¶n so víi mÉu gièng gèc khi míi ®­îc nu«i cÊy vµ ph¸t triÓn æn ®Þnh.

2.10. Håi phôc gièng: lµ qu¸ tr×nh cÊy chuyÓn vi sinh vËt tõ mÉu b¶o qu¶n vµo m«i tr­êng dinh d­ìng thÝch hîp ®Ó vi sinh vËt kh«i phôc l¹i c¸c tÝnh tr¹ng ban ®Çu.

3. Néi dung:

3.1. Trang thiÕt bÞ:



  • Tñ sÊy (thiÕt bÞ tiÖt trïng kh«) vµ nåi hÊp ¸p lùc (thiÕt bÞ tiÖt trïng ­ít)

  • Tñ Êm

  • Tñ cÊy v« trïng

  • Tñ l¹nh s©u

  • B×nh ®Ó mÉu vi sinh vËt cã chøa nit¬ láng

  • B×nh tr÷ nit¬ láng

  • G¨ng tay (Poleyolefin)

  • èng nghiÖm polypropylen cã nót xo¸y, dung tÝch 2ml, chÞu nhiÖt ®é thÊp, khö trïng ®­îc hoÆc ampul thuû tinh trung tÝnh

  • C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g

  • Que cÊy

  • Que g¹t thñy tinh

  • èng nghiÖm thñy tinh

  • èng ®ong

  • B×nh tam gi¸c

  • §Üa petri (hép lång)

  • Pipet chia ®é, pipetman

  • §Ìn cån hoÆc ®Ìn gas

3.2. TiÕn hµnh:

3.2.1. ChuÈn bÞ dông cô:



  • C¸c dông cô dïng trong x¸c ®Þnh vi sinh vËt ph¶i tiÖt trïng b»ng mét trong c¸c ph­¬ng ph¸p d­íi ®©y:

+ Trong tñ sÊy ë nhiÖt ®é 160 - 1750C kh«ng Ýt h¬n 2 giê.

+ Trong nåi hÊp ¸p lùc 1atmotphe (1210C) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.



  • ChuÈn bÞ èng nghiÖm polypropylen (hoÆc ampul): ng©m trong dung dÞch HCl 2% trong 12 giê. Sau ®ã röa l¹i b»ng n­íc m¸y 3 - 4 lÇn vµ tr¸ng l¹i b»ng n­íc cÊt råi khö trïng trong nåi hÊp ¸p lùc 1atmotphe (1210C) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.

3.2.2. ChuÈn bÞ m«i tr­êng:

  • M«i tr­êng nu«i cÊy sinh khèi vµ kiÓm tra ®é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng lµ m«i tr­êng nu«i cÊy chän läc (môc 2.5).

  • C©n vµ hoµ tan c¸c thµnh phÇn m«i tr­êng trong n­íc cÊt theo thø tù ®· cho. Ph©n phèi m«i tr­êng vµo c¸c b×nh tam gi¸c. §Ëy nót b«ng, khö trïng ë ®iÒu kiÖn phï hîp cho tõng lo¹i m«i tr­êng.

  • M«i tr­êng b¶o vÖ: cã tû lÖ s÷a t¸ch b¬ 10% (w/v), hoÆc glyxerol 10% (v/v), hoÆc Dimetyl sunfoxide (DMSO) 5% (v/v). M«i tr­êng b¶o vÖ cÇn ®­îc tiÖt trïng b»ng ph­¬ng ph¸p Pasteur, hoÆc mµng läc vi khuÈn hoÆc ë 1210C trong 15 phót.

3.2.3. ChuÈn bÞ mÉu gièng:

  • Mét mÉu gièng vËt liÖu cÇn gi÷ mét l­îng mÉu lÆp l¹i kh«ng Ýt h¬n ba lÇn.

  • Kh«ng ®­îc chän nh÷ng khuÈn l¹c riªng biÖt trong c¸c lÇn cÊy chuyÓn lµm gièng (tr¸nh ®ét biÕn sinh tr­ëng).

  • ViÖc lÊy mÉu ®­îc tiÕn hµnh sao cho mÉu kiÓm tra ph¶i lµ mÉu thuÇn. Ng­êi lÊy mÉu ph¶i ®­îc huÊn luyÖn vµ cã kinh nghiÖm trong viÖc lÊy mÉu.

  • Trong qu¸ tr×nh lÊy mÉu, vËn chuyÓn vµ xö lý mÉu ph¶i ®¶m b¶o tr¸nh sù t¹p nhiÔm tõ bªn ngoµi vµ ®¶m b¶o ®­îc tÝnh nguyªn tr¹ng ban ®Çu.

3.2.4. ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï: theo 2 c¸ch

3.2.4.1. ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï tõ mÉu gièng nu«i cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng:



  • C¸c mÉu gièng ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng thÝch hîp. Sau khi tÕ bµo ph¸t triÓn tèt, æn ®Þnh (pha sinh tr­ëng), thu sinh khèi vi sinh vËt ®Ó tiÕn hµnh b¶o qu¶n.

  • Dïng pipet v« trïng hót 5ml m«i tr­êng dinh d­ìng (NB) chøa 10% (v/v) glycerol hoÆc 5% (v/v) DMSO hoÆc 10% (w/v) s÷a t¸ch b¬ vµo mçi èng th¹ch nghiªng.

  • Dïng pipet v« trïng hót 5ml m«i tr­êng dinh d­ìng (NB) chøa 10% (v/v) glycerol hoÆc 5% (v/v) DMSO hoÆc 10% (w/v) s÷a t¸ch b¬ vµo mçi èng th¹ch nghiªng.

  • Dïng dông cô v« trïng ®¸nh tan toµn bé sinh khèi trªn bÒ mÆt th¹ch nghiªng vµo m«i tr­êng, sau ®ã hót toµn bé dÞch huyÒn phï tÕ bµo, ®¶m b¶o mËt ®é tÕ bµo Ýt nhÊt lµ 108 tÕ bµo/ml.

  • Dïng pipet v« trïng ph©n 1ml cña dÞch huyÒn phï tÕ bµo vµo èng nghiÖm polypropylen, vÆn chÆt nót. Cã thÓ sö dông ampul thuû tinh, g¾n ®Çu ampul b»ng ®Ìn khß. Kh«ng ®Ó r©y dÞch vi sinh lªn mÐp hoÆc thµnh èng nghiÖm polypropylen hoÆc ampul.

  • §Æt ampul trong tñ l¹nh 50C trong 30 phót ®Ó ®¹t ®­îc sù æn ®Þnh gi÷a tÕ bµo vµ m«i tr­êng.

3.2.4.2. ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï tõ mÉu gièng nu«i cÊy trªn m«i tr­êng dÞch thÓ:

  • C¸c mÉu gièng ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng dÞch thÓ thÝch hîp. Sau khi tÕ bµo ph¸t triÓn tèt, æn ®Þnh, tiÕn hµnh b¶o qu¶n b»ng nit¬ láng.

  • Dïng pipet v« trïng bæ sung mét l­îng 20% (v/v) glycerol hoÆc 10% (v/v) DMSO hoÆc 20% s÷a t¸ch b¬ ®· khö trïng b»ng thÓ tÝch cña dÞch vi sinh vËt ®Ó ®¹t nång ®é glycerol cuèi cïng 10% (v/v) hoÆc DMSO 5% (v/v) hoÆc s÷a t¸ch b¬ 10% (w/v).

  • L¾c nhÑ ®Ó thu ®­îc dÞch huyÒn phï tÕ bµo ®ång ®Òu, ®¶m b¶o mËt ®é tÕ bµo Ýt nhÊt lµ 108 tÕ bµo/ml. NÕu gièng vi sinh vËt mäc thµnh viªn nhá hay thµnh ®¸m lín, cã thÓ dïng m¸y nghiÒn m« nhá hoÆc cèi sø v« trïng ®Ó nghiÒn n¸t.

  • Dïng pipet v« trïng ph©n 1ml cña dÞch huyÒn phï tÕ bµo vµo èng nghiÖm polypropylen, vÆn chÆt nót. Cã thÓ sö dông ampul thuû tinh, g¾n ®Çu ampul b»ng ®Ìn khß. Kh«ng ®Ó r©y dÞch vi sinh lªn mÐp hoÆc thµnh èng nghiÖm polypropylen hoÆc ampul.

  • §Æt ampul trong tñ l¹nh 50C trong 30 phót ®Ó ®¹t ®­îc sù æn ®Þnh gi÷a tÕ bµo vµ m«i tr­êng.

3.2.5. Qu¸ tr×nh b¶o qu¶n b»ng nit¬ láng: ®­îc tiÕn hµnh nh­ sau:

  • §Æt èng nghiÖm polypropylen (ampul) vµo trong khay nh«m. Sau ®ã ®Æt vµo buång lµm l¹nh cña m¸y lµm l¹nh.

  • §iÒu chØnh tèc ®é lµm l¹nh 1-20C/phót ®Õn khi nhiÖt ®é ®¹t ©m 300C. Sau ®ã tiÕp tôc ®iÒu chØnh tèc ®é lµm l¹nh 10C/phót ®Õn khi nhiÖt ®é ®¹t kh«ng nhá h¬n ©m 500

  • Nhanh chãng chuyÓn èng nghiÖm polypropylen (ampul) ®Õn vÞ trÝ b¶o qu¶n cuèi cïng trong b×nh nit¬ láng (nhiÖt ®é tõ ©m1560C ®Õn ©m 1960C).

Ghi chó: CÇn ®i g¨ng tay poleyolefin khi thao t¸c ®Ó tr¸nh bÞ báng tay.

3.3. KiÓm tra gièng:

§Þnh kú hµng n¨m kiÓm tra ®é sèng sãt vµ ®Æc tÝnh sinh häc cña gièng. ChØ cho phÐp gi÷ l¹i c¸c gièng cã ®é sèng sãt vµ cã ho¹t tÝnh sinh häc æn ®Þnh nh­ gièng gèc.

3.3.1. KiÓm tra ®é sèng sãt cña gièng:

3.3.1.1. M«i tr­êng ®Ó kiÓm tra:

Dïng m«i tr­êng nu«i cÊy chän läc lµ m«i tr­êng ®Ó kiÓm tra. M«i tr­êng ®­îc pha chÕ theo thø tù c¸c ho¸ chÊt trong thµnh phÇn ®· cho. Sau ®ã ph©n phèi vµo c¸c dông cô thuû tinh ®· chuÈn bÞ tr­íc råi khö trïng ë nh÷ng ®iÒu kiÖn phï hîp. §Ó nguéi m«i tr­êng ®Õn 45-500C råi ph©n phèi vµo c¸c ®Üa petri v« trïng. Thao t¸c nµy ®­îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn v« trïng.

3.3.1.2. DÞch pha lo·ng: N­íc muèi sinh lý (NaCl 0,85%), kh«ng chøa c¸c hîp chÊt nit¬, sau khi khö trïng cã ®é pH lµ 7,0.

Ph©n phèi dÞch pha lo·ng vµo c¸c èng nghiÖm cã dung tÝch thÝch hîp víi mét l­îng sao cho sau khi khö trïng, mçi èng nghiÖm chøa 9ml. Lµm nót b«ng vµ khö trïng ë 1 atmotphe (1210C) trong 30 phót.

NÕu ch­a sö dông ngay, dÞch pha lo·ng cÇn ®­îc b¶o qu¶n trong tñ l¹nh ë nhiÖt ®é 4-100C, thêi gian b¶o qu¶n kh«ng qu¸ 1 th¸ng kÓ tõ ngµy chuÈn bÞ.

Ghi chó: §Ó tr¸nh lµm ¶nh h­ëng ®Õn c¸c vi sinh vËt do thay ®æi nhiÖt ®é ®ét ngét, nªn ®iÒu chØnh nhiÖt ®é cña dÞch pha lo·ng ®Õn nhiÖt ®é phßng thö nghiÖm tr­íc khi sö dông.

3.3.1.3. ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï tÕ bµo (suspension):



  • LÊy èng gièng b¶o qu¶n cÇn kiÓm tra ra khái b×nh nit¬ láng, cho b¨ng tan tù nhiªn (trong ®iÒu kiÖn phßng thö nghiÖm).

  • Lau bªn ngoµi cña èng nghiÖm polypropylen (ampul) b»ng g¹c v« trïng cã thÊm etanol 70% (v/v), ®Æc biÖt chó ý ®Õn vïng gi÷a nót vµ th©n èng.

  • Më nót èng nghiÖm polypropylen (ampul) trong ®iÒu kiÖn v« trïng. Dïng b¬m tiªm ®· v« trïng hót 1ml dÞch huyÒn phï trong èng nghiÖm cho vµo 9 ml dÞch pha lo·ng, tr¸nh ch¹m b¬m tiªm vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-10 gi©y. LÆp l¹i c¸c thao t¸c nµy ®Ó thu ®­îc dÞch pha lo·ng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.

  • CÊy mÉu: dïng pipet v« trïng lÊy tõ dÞch mÉu pha lo·ng mét l­îng 0,05 ml mÉu (1 giät) cÊy vµo 1 ®Üa petri chøa m«i tr­êng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.3.1). Mçi mÉu pha lo·ng ®­îc cÊy vµo 3 ®Üa petri (mçi ®é pha lo·ng sö dông 1 pipet v« trïng riªng).

  • Dïng que g¹t v« trïng g¹t ®Òu dÞch mÉu trªn bÒ mÆt th¹ch, ®îi kh« bÒ mÆt th¹ch, óp ng­îc ®Üa petri, ®Ó trong tñ Êm víi nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp.

  • §Õm sè l­îng khuÈn l¹c ®Æc tr­ng cña mÉu gièng vi sinh vËt trªn mçi ®Üa petri.

  • MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra (ml) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau:

Trong ®ã:

A: Sè khuÈn l¹c/ml dÞch;

a: Sè khuÈn l¹c trung b×nh cã trong ®Üa petri;

d: Nång ®é dÞch pha lo·ng;

20: Sè giät dÞch trong 1 ml dÞch.



Ghi chó: Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh ®­îc tÝnh lµ trung b×nh céng sè khuÈn l¹c cña c¸c ®Üa petri ®­îc c©ý tõ cïng mét ®é pha lo·ng, trong ®ã chØ tÝnh c¸c ®Üa petri chøa tõ 30-300 khuÈn l¹c. Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh còng cã thÓ ®­îc tÝnh lµ trung b×nh

céng sè l­îng khuÈn l¹c cña c¸c ®Üa petri ®­îc cÊy tõ hai ®é pha lo·ng kÕ tiÕp nhau b»ng c¸ch tÝnh sè khuÈn l¹c trung b×nh céng ë mçi ®é pha lo·ng, trong ®ã sè khuÈn l¹c ë ®é pha lo·ng cao h¬n ®­îc nh©n víi 10, sau ®ã lÊy trung b×nh céng cña hai gi¸ trÞ trªn nÕu tû sè gi÷a gi¸ trÞ lín vµ gi¸ trÞ nhá kh«ng lín h¬n 2. NÕu tû sè nµy lín h¬n 2 th× lÊy gi¸ trÞ nhá lµm kÕt qu¶. MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra ®­îc biÓu thÞ b»ng mét sè gi÷a 1,00 vµ 9,99 nh©n víi 10n, n lµ sè mò thÝch hîp.

MËt ®é tÕ bµo mÉu gièng b¶o qu¶n

% sèng sãt = ---------------------------------------------- x 100

MËt ®é tÕ bµo mÉu gièng gèc

3.3.2. X¸c ®Þnh ®Æc tÝnh sinh häc:



TiÕn hµnh theo nh÷ng ph­¬ng ph¸p cô thÓ phô thuéc vµo ®Æc tÝnh sinh häc cña tõng chñng vi sinh vËt.




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương