28 tcn 186 : 2003 Hàm lượng cloramphenicol trong sản phẩm thuỷ sản Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí

1        Phạm vi áp dụng

2        Phương pháp tham chiếu

3        Nguyên tắc

4        Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1       Hệ thống GC với đầu dò ECD và bộ phận tiêm mẫu tự động.

4.1.2 Cột mao quản HP-5, kích thước 25m x 0,2 mm, lớp film 5% phenyl metyl silicon dày 0,33 mm hoặc cột tương đương.

4.1.3 Hệ thống cô quay chân không: Buchi R 110 hoặc tương đương.

4.1.4 Hệ thống cô N - Evap model 111 hoặc tương đương.

4.1.5 Xilanh 10 ml.

4.1.6 Bình quả lê dung tích 100 ml.

4.1.7 ống ly tâm dung tích 15 ml, 50 ml.

4.1.8 Pipet Pasteur với quả bóp cao su.

4.1.9 Máy ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút.

4.1.10 Máy rung trộn mẫu.

4.1.11 Máy nghiền đồng thể.

4.2 Hoá chất

4.2.1 Etyl axetat.

4.2.2 Nước loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Hexan.

4.2.4 Toluen.

4.2.5 Natri clorua (NaCl).

4.2.6 Tác nhân tạo dẫn xuất Trimetyl silyl: Sylon HTP kit.

4.2.7 Chuẩn CAP.

4.2.8 Chất nội chuẩn m-nitro CAP (M-CAP).

4.2.9 Metanol.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch muối 4 %: hoà tan 40 g NaCl (4.2.5) trong 1000 ml nước cất (4.2.2).

4.3.2 Dung dịch nội chuẩn CAP gốc (100 mg/ml): cân 10,0 mg CAP (4.2.7) vào bình định mức dung tích 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch 100 ml bằng metanol (4.2.9).

4.3.3 Dung dịch nội chuẩn CAP làm việc (1000 ng/ml): hút chính xác 1,00 ml dung dịch chuẩn CAP gốc (4.3.2) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng Metanol (4.2.9).

4.3.4 Dung dịch chuẩn M-CAP gốc (100 mg/ml): cân 10,0 mg M-CAP (4.2.8) vào bình định mức 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch 100 ml bằng metanol (4.2.9).

4.3.5 Dung dịch chuẩn M-CAP làm việc (1000 ng/ml): hút chính xác 1,00 ml dung dịch chuẩn M-CAP gốc (4.3.4) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.9).

4.3.6 Dung dịch các chuẩn đã được tạo dẫn xuất: hút chính xác 100 ml dung dịch từ các chuẩn làm việc (4.3.3) và (4.3.5) vào ống ly tâm 15 ml (4.1.7). Làm khô bằng dòng nitơ. Tạo dẫn xuất như được mô tả ở tại Ðiều 5.4, nhưng thể tích cuối cùng là 1,0 ml.

4.3.7 Dung dịch CAP (100 ng/ml): hút chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn CAP làm việc (4.3.3) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.9).

4.3.8 Dung dịch M-CAP (100 ng/ml): hút chính xác 10,0 ml dung dịch nội chuẩn M-CAP làm việc (4.3.5) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.9)

5        Phương pháp tiến hành

5.1         Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1       Cân 10,0 g mẫu thuỷ sản đã được nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml (4.1.7). Thêm 100 ml dung dịch M - CAP làm việc (4.3.5) và 20 ml etyl axetat (4.2.1) vào trong ống rồi nghiền bằng máy nghiền đồng thể (4.1.11) trong khoảng 10 -15 giây. Sau đó, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê 100 ml (4.1.6).

5.1.2       Cho thêm 20 ml etyl axetat (4.2.1) vào phần cặn trong ống ly tâm rồi trộn đều. Sau đó, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê ở trên.

5.1.3       Cô dịch trong bình quả lê trên máy cô quay chân không (4.1.3) cho đến khi còn khoảng 2,0 - 4,0 ml dung dịch ở nhiệt độ 50^oC. Chuyển dịch còn lại sang ống ly tâm 50 ml bằng pipet Pasteur. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần bằng 2,0 ml etyl axetat. Tất cả dịch rửa được cho vào ống ly tâm.

5.1.4       Cô cạn dung dịch trong ống ly tâm bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50^oC.

5.1.5       Thêm 25 ml dung dịch muối NaCl 4 % (4.3.1), 2 ml metanol (4.2.9) và 15 ml hexan (4.2.3) vào ống ly tâm. Ðậy nắp ống ly tâm và lắc thật mạnh trong 1 phút. Sau đó, ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 800 vòng/phút.

5.1.6       Loại bỏ lớp hexan ở trên bằng pipet Pasteur (4.1.8). Lặp lại quá trình này thêm 2 lần, mỗi lần 15 ml hexan.

5.1.7 CAP trong pha nước được chuyển sang pha hữu cơ bằng cách lắc mạnh với 15 ml etyl axetat (4.2.1) trong 30 giây. Ly tâm hỗn hợp trong 1 phút ở tốc độ 800 vòng/phút. Dùng pipet Pasteur chuyển lớp etyl axetat ở trên vào bình quả lê 100 ml (4.1.6). Lặp lại quá trình này một lần nữa với 15 ml etyl axetat (4.2.1). Dịch chiết cũng được đưa vào bình quả lê.

5.1.8 Cô hỗn hợp dịch chiết (5.1.7) còn lại khoảng 2 - 4 ml trên máy quay chân không ở nhiệt độ 55^oC. Chuyển lượng dịch còn lại vào ống ly tâm 15 ml. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần với 2 ml etyl axetat. Cô cạn dịch thu được bằng dòng nitơ ở nhiệt độ 50^oC. Chuyển tiếp sang bước tạo dẫn xuất Sylyl theo Ðiều 5.4.

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Cho thêm 30,0 ml dung dịch chuẩn CAP 0,1 mg/ml (4.3.7) và 30 ml dung dịch chuẩn M-CAP 0,1 mg/ml (4.3.8) vào 10,0g mẫu trắng rồi tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử qui định tại Ðiều 5.1.

5.4 Tạo dẫn xuất Sylyl

5.5 Tiến hành phân tích trên hệ thống GC

5.5.1 Ðiều kiện phân tích

a. Chương trình nhiệt độ cột:

- Tăng từ nhiệt độ 150⁰C lên nhiệt độ 270⁰C với tốc độ 20⁰C/phút, giữ 8,5 phút.

- Tăng từ nhiệt độ 270⁰C lên nhiệt độ 290⁰C với tốc độ 20⁰C/phút, giữ 2,0 phút.

b. Nhiệt độ đầu tiêm: 270^oC.

c. Nhiệt độ detector: 340^oC.

d. Tốc độ dòng khí mang He: 1 ml/phút.

đ. Khí bổ trợ: N₂, theo điều kiện của GC.

e. Thể tích tiêm: 1 ml.

5.5.2 ổn định cột sắc ký trong 3 giờ tại chế độ làm việc.

5.5.3 Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất (4.3.6) trước và sau mỗi 5 dung dịch thử. Xác định tỷ số diện tích pic (CAP/ M-CAP).

5.5.4 Tiêm các dung dịch đã được tạo dẫn xuất của mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi vào hệ thống GC mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được theo Ðiều 6.

5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

5.6.2 Ðộ thu hồi (R)

5.6.3 Kiểm tra xác nhận (confirmatory test)

Ðối với các mẫu đã phát hiện Cloramphenicol bằng phương pháp GC-ECD này, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng GC-MS.

6        Tính kết quả

 

X x C x V

Trong đó:

- X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/M-CAP) cho dung dịch mẫu thử.

- C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất (4.3.6), tính theo ng/g.

- V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml.

- Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/M-CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất (4.3.6).